基于線粒體COI基因序列的4個(gè)海域口蝦蛄群體的遺傳多樣性研究

董 鑫, 邢 坤, 隋宥珍, 劉海映

(大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院, 大連 116023)

口蝦蛄(Oratosqilla oratoria)隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼動(dòng)物亞門(Crustacea)、軟甲綱(Malacostraca)、口足目(Stomatopoda)、蝦蛄科(Squilidae)、口蝦蛄屬(Oratosquilla)[1], 俗稱蝦爬子、螳螂蝦、蝦虎等, 具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 是中國(guó)沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)蝦類之一。近年來(lái), 人們對(duì)海鮮食品的需求不斷增加, 因而加速了人們對(duì)海洋經(jīng)濟(jì)生物的索取力度, 口蝦蛄作為中國(guó)近海捕撈的優(yōu)勢(shì)種[2],其資源量隨著捕撈壓力的增大而逐步減小[3], 加之生態(tài)環(huán)境的不斷惡化, 野生口蝦蛄資源受到嚴(yán)重威脅, 所以亟需對(duì)口蝦蛄的種質(zhì)資源現(xiàn)狀進(jìn)行研究。

目前對(duì)口蝦蛄的研究多集中在形態(tài)學(xué)[4]、生物學(xué)特征[5], 生理生態(tài)[6]和人工育苗[7]等方面, 關(guān)于從分子水平上研究其種群遺傳多樣性的報(bào)道也日漸增多,Zhang等[8]用 11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記初步分析了葫蘆島、青島、煙臺(tái)3個(gè)海域口蝦群體的遺傳多樣性狀況, 得到觀測(cè)等位基因數(shù)為2～11個(gè)不等, 遺傳多樣性水平較高。張代臻[9-13]等用細(xì)胞色素 C氧化酶亞基I(mtDNACOI)標(biāo)記的方法研究了黃海海域、渤海海域和粵東海域口蝦蛄的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu), 結(jié)果顯示黃海海域口蝦蛄的單倍型多樣性和核苷酸多樣性水平均高于渤海海域而低于粵東海域。目前尚未見(jiàn)應(yīng)用線粒體COI標(biāo)記的方法對(duì)包括南北方海域的口蝦蛄野生種質(zhì)資源現(xiàn)狀進(jìn)行綜合詳細(xì)報(bào)道。

線粒體DNA(mitochondrial DNA, 簡(jiǎn)稱mtDNA)相對(duì)于核DNA具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、進(jìn)化速率快、幾乎不發(fā)生重組、富含系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)等特點(diǎn), 是作為種屬進(jìn)化研究的良好標(biāo)記[14]。其中,COI是目前應(yīng)用最多、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化動(dòng)力學(xué)研究比較清楚的基因之一, 且其能被通用引物所擴(kuò)增, 所以被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物近緣種間的系統(tǒng)進(jìn)化研究。本研究對(duì)分布于皮口、綏中、青島、廣州 4個(gè)海域口蝦蛄群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究, 以期為口蝦蛄野生種質(zhì)資源的合理開(kāi)發(fā)和保護(hù)提供分子生物學(xué)依據(jù), 并為口蝦蛄在COI方面的研究積累更多可利用數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料是2011年～2013年采集于皮口、綏中、青島、廣州 4個(gè)海域的口蝦蛄樣本, 共計(jì) 100只(表1)。樣本活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后, 置于–80℃冰箱中冷凍備用。

表1 口蝦蛄樣本采集信息Tab. 1 Oratosqilla oratoria sampling information

1.2 DNA的提取、擴(kuò)增及測(cè)序

用已滅菌的剪刀取口蝦蛄背部肌肉組織, 置于加入液氮的研缽中充分研磨, 用購(gòu)于上海生工的Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取, DNA溶解于 TE溶液中, 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其純度后–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

COI擴(kuò)增所用引物為通用引物, 引物序列:LCO1490: 5′-GGTCAAATCATAAAGATATTGG-3′和HCO2198: 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。PCR 反應(yīng)的總體積為 25 μL, 其中 10×Buffer2.5 μL、Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL、dNTPs(各 2.5 mmol/L)2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、DNA 模板 1 μL、ddH2O 補(bǔ)足體積。在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增, 反應(yīng)程序均為94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30s, 50℃退火30 s, 72℃延伸90 s, 32個(gè)循環(huán); 72℃最后延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照和比較, 挑選較好的 PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序, 測(cè)序儀為XL3730基因分析儀。

1.3 外群的選擇及序列分析

鬼蝦蛄(Squilla empusa)在分類學(xué)上與口蝦蛄關(guān)系密切, 因此本研究選擇鬼蝦蛄作為外群分析口蝦蛄野生群體的親緣關(guān)系[15]。

用 ClustalX 1.83[16]對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)并人工校對(duì)。采用Mega4.0[17]軟件統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換和顛換的比率和不同群體間的遺傳距離, 并以鄰接法[18](Neighbor-Joining,NJ)基于 Kimura雙參數(shù)(Kimura 2-parameter)模型構(gòu)建群體和單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(以 Bootstrap法[19]1000次重復(fù)來(lái)檢驗(yàn)系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度)。用DnaSp5.1軟件[20]計(jì)算群體的單倍型數(shù), 單倍型多態(tài)性(Hd), 核苷酸多樣性指數(shù)(π)及平均核苷酸差異數(shù)(K)等。應(yīng)用 Arlequin3.5軟件中的分子方差分析(AMOVA)估算遺傳變異的分布和遺傳分化系數(shù)(F-statistics,Fst)[21]。用軟件TCS1.21[22]來(lái)分析單倍型的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI序列特征及遺傳多樣性分析

本研究采用的是無(wú)脊椎動(dòng)物通用引物, 對(duì) 4個(gè)海域口蝦蛄COI進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序, 共得到100個(gè)樣本的COI序列, 經(jīng) ClustalX 比對(duì)后, 去除引物及序列起始的部分序列, 與 GenBank上下載的口蝦蛄的同源COI基因序列進(jìn)行MEGA比對(duì)后, 確認(rèn)得到 585bp的序列。 4個(gè)群體的堿基組成基本一致,COI基因序列的A、G、C、T平均含量分別為28.2%、17.6%、17.6%、36.6%, A+T含量(64.8%)顯著高于G+T含量(35.2%)4個(gè)群體口蝦蛄所有序列中共存在簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)54個(gè)。轉(zhuǎn)換與顛換的平均比值是7.84,轉(zhuǎn)換高于顛換。

所有樣本共定義 35個(gè)單倍型, 分別命名為Hap1～Hap35(表2)。在皮口、綏中、青島和廣州共檢測(cè)到的單倍型數(shù)分別為14個(gè)、17個(gè)、16個(gè)和11個(gè)。其中5個(gè)單倍型涵蓋的樣本數(shù)最多, 分別為Hap1、Hap2、Hap7、Hap8和Hap16。被共享個(gè)體數(shù)最多的是Hap2, 為皮口, 青島, 綏中3個(gè)海域的26個(gè)樣本所共享。被兩個(gè)以上種群共享的單倍型有16個(gè), 被3個(gè)以上種群共享的單倍型有7個(gè), 即Hap1、Hap2、Hap6、Hap7、Hap8、Hap16、Hap20。4個(gè)群體的單倍型及遺傳多樣性系數(shù)見(jiàn)表3。4個(gè)群體的整體單倍型多樣性和平均核苷酸多樣性值是0.9162和0.0203。單倍型多樣性最高的為廣州群體(Hd=0.9338), 最低為皮口群體(Hd=0.8783)。核苷酸多樣性以廣州群體最高(π=0.0049), 以皮口群體最低(π=0.0032)。4個(gè)海域中廣州群體的遺傳多樣性最高, 明顯高于其他3個(gè)海域。

表2 口蝦蛄COI序列的核苷酸變異位點(diǎn)及各單倍型的分布Tab. 2 Distribution of nucleotide variation sites and haplotypes in COI sequences of O.oraotoria

表3 基于COI基因序列得出的4個(gè)口蝦蛄群體遺傳多樣性參數(shù)Tab. 3 Parameters of genetic diversity in 4 O.oratoria populations based on COI sequences

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用COI序列比較4個(gè)海域口蝦蛄種群的遺傳分化, 由 Arlequin3.5軟件的 AMOVA計(jì)算表明, 來(lái)自于群體間的遺傳差異(84.53%)明顯高于來(lái)自群體內(nèi)的差異(15.47%)(表 4)。遺傳分化系數(shù)(Fst)在廣州與皮口群體間最高(Fst=0.9358)(表5)。皮口、綏中、青島3個(gè)群體的Fst值均為負(fù)值, 表明3個(gè)群體間幾乎沒(méi)有發(fā)生遺傳分化, 存在高度的遺傳同質(zhì)性; 而廣州與皮口、綏中、青島3個(gè)群體間的Fst值(0.9287～0.9358)均較高, 說(shuō)明廣州群體與其他 3個(gè)群體間的遺傳分化很大。

表4 4個(gè)口蝦蛄群體線粒體COI變異區(qū)序列的AMOVA結(jié)果Tab. 4 The result of AMOVA based on COI gene of mtDNA in 4 O.oratoria populations

表5 4個(gè)口蝦蛄群體間的平均遺傳距離和Fst值Tab. 5 Mean distance between 4 O.oratoria populations and Fst

采用MEGE4.0 軟件根據(jù)Kimura 雙參數(shù)模型計(jì)算各群體間的遺傳距離, 由表5可知, 皮口和綏中群體的遺傳距離最近, 為 0.00357; 廣州和綏中群體的遺傳距離最遠(yuǎn), 為 0.04574。廣州與皮口、青島、綏中 3個(gè)群體間的遺傳距離均較遠(yuǎn)(0.04567～0.04574),皮口、青島、綏中群體間的遺傳距離很近(0.00357～0.00370)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育和嵌套分析

從GenBank下載19條粵東海域(汕尾和深圳)的口蝦蛄COI序列和鬼蝦蛄的COI序列, 與本研究所檢測(cè)的100條口蝦蛄樣本的COI同源基因序列構(gòu)建群體的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖 1), 整體分析系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。由圖1可知, 進(jìn)化樹(shù)主要分為3個(gè)分支: 皮口、綏中、青島 3個(gè)海域口蝦蛄群體遺傳距離較近首先聚為一個(gè)小支, 與廣州和粵東(汕尾和深圳)海域口蝦蛄群體相聚的小支聚為一個(gè)大支, 最后才與外群鬼蝦蛄群體聚在一起。從構(gòu)建的單倍型NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出(圖2), 綏中、青島、皮口3個(gè)海域的口蝦蛄的所有個(gè)體以嵌套的方式聚集在一起, 沒(méi)有形成明顯的地理格局, 廣州群體特有的單倍型形成單獨(dú)的分支。

基于單倍型的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖 3)(圓代表單倍型, 斜線代表演變事件, 小圓點(diǎn)代表未檢測(cè)到的單倍型)可知, 廣州群體特有單倍型形成的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖獨(dú)立于皮口、綏中和青島單倍型形成的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖之外, 形成了明顯的地理譜系結(jié)構(gòu), 廣州單倍型與其他3個(gè)群體單倍型遺傳分化明顯。

圖1 基于COI基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Neighbor-joining tree based on COI gene sequences

圖2 35個(gè)口蝦蛄單倍型的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Neighbor-joining tree of 35 O.oratoria haplotypes

圖3 口蝦蛄群體所有單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig. 3 Haplotype network from all haplotypes based on COI sequence of O.oratoria

圖3顯示, 在皮口、綏中和青島單倍型形成的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中, Hap2是最主要最原始的單倍型,Hap1、Hap8、Hap9、Hap16、Hap21、Hap23和 Hap24是由其直接拓展而出, 呈星狀輻射分布, 其他單倍型由以上 7個(gè)單倍型間接拓展出來(lái), 其中由 Hap16拓展出的單倍型數(shù)最多, 皮口、綏中和青島單倍型沒(méi)有明顯的分化, 24個(gè)單倍型以相互交錯(cuò)的形式聚合在一起。在廣州特有單倍型形成的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中, Hap31是最原始的單倍型, Hap26、Hap29和Hap34以一步突變與其連接在一起, 其他單倍型從以上3個(gè)單倍型間接拓展出來(lái), 其中Hap26、Hap27、Hap30和Hap33聚合成一組, 顯示出較近的親緣關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所研究的口蝦蛄100條COI同源序列中,A、G、C、T的平均含量為28.2%、17.6%、17.6%、36.6%, 這與江蘇連云港與鹽城海域(A=27.6%、G=17.7%、C=17.6%、T=37.1%)[10]、粵東海域(A=27.1%、G=18.9%、C=17.6%、T=36.4%)[13]、渤海灣葫蘆島海域(A=27.8%、G=17.9%、C=17.6%、T=36.8%)[11]、黃海海域(A=27.5%、G=17.8%、C=17.6%、T=37.1%)[9]所研究的口蝦蛄平均堿基組成相當(dāng), 說(shuō)明口蝦蛄COI序列具有相似的組成特點(diǎn)。A+T含量(64.8%)明顯高于G+C含量(35.2%), 該結(jié)果與許多研究者在農(nóng)田金龜子、蝦類、蟹類等COI中觀察到的結(jié)果相似[23-25],AT含量高是節(jié)肢動(dòng)物線粒體DNA堿基組成中普遍存在的現(xiàn)象。本研究中, 轉(zhuǎn)換與顛換的平均比值是7.84, 轉(zhuǎn)換高于顛換, 說(shuō)明4個(gè)群體中口蝦蛄COI序列替換未達(dá)到飽和。一般在 mtDNA序列的變異中,轉(zhuǎn)換較易在近親種間頻繁發(fā)生, 而顛換則發(fā)生在遠(yuǎn)緣種間, 在同物種內(nèi)部, 轉(zhuǎn)換高于顛換[26]。

遺傳多樣性參數(shù)是衡量群體遺傳多樣性程度的重要指標(biāo)之一。根據(jù)線粒體基因序列的單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π), 將海洋生物的遺傳多樣性分為 4種類型: 低Hd(<0.5)和低π(<0.5%), 高Hd(>0.5)和低π(<0.5%), 低Hd(<0.5)和高π(>0.5%),高Hd(>0.5)和高π(>0.5%)[27]。本研究中 4個(gè)群體的遺傳多樣性均表現(xiàn)出高的單倍型多樣性和低的核苷酸多樣性的特點(diǎn), 因此屬于第二種類型, 說(shuō)明4個(gè)海域口蝦蛄群體的遺傳多樣性均處于中等水平。廣州海域口蝦蛄群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均為最高, 可知廣州海域口蝦蛄的遺傳多樣性最高。近年來(lái), 雖然中國(guó)近?？谖r蛄的捕撈量有所下降, 但其現(xiàn)存資源量仍很高[28], 因此, 盡管口蝦蛄資源處于過(guò)度捕撈的狀態(tài), 然而大的資源量仍維持了口蝦蛄中等水平的遺傳多樣性。群體這種高的單倍型多樣性和低的核苷酸多樣性的特點(diǎn), 表明物種經(jīng)歷了一個(gè)由較小的有效種群在近期快速增長(zhǎng)為一個(gè)大的種群的過(guò)程[27]。本研究中的 4個(gè)口蝦蛄群體的平均核苷酸多樣性(π=0.0203)明顯高于粵東海域[13](π=0.00755)、渤海灣[12](π=0.00485)和黃海海域[9](π=0.00512)的口蝦蛄群體, 整體單倍型多樣性與以上海域研究結(jié)果相當(dāng), 是由于本研究中的口蝦蛄樣本來(lái)自中國(guó)的黃海(皮口和青島)、渤海(綏中)和南海(廣州)3大海域, 取樣范圍較以往研究都大, 因此口蝦蛄的核苷酸多態(tài)性高。

遺傳距離是評(píng)價(jià)種群遺傳變異差異水平的另一重要指標(biāo)。根據(jù)MEGA4.0計(jì)算的遺傳距離分析, 皮口和綏中海域口蝦蛄的遺傳距離最近(0.00357), 廣州和綏中海域口蝦蛄的遺傳距離最遠(yuǎn)(0.04574)。研究認(rèn)為, 遺傳距離在 0.01以上的, 表示群體的遺傳變異較大[29], 廣州與其他 3個(gè)群體間的遺傳差異值均顯著大于 0.01, 反映了廣州群體較大的遺傳變異水平, 這可能是由于廣州口蝦蛄棲息地保護(hù)較好,沒(méi)有遭到人為破壞, 種群發(fā)展比較穩(wěn)定, 積累的變異較多, 因此遺傳變異水平較高; 皮口、綏中、青島群體間的遺傳距離均小于0.01, 表明3個(gè)群體的遺傳差異較小, 3個(gè)海域口蝦蛄之間有著頻繁的基因交流,這可能是由于口蝦蛄為廣溫、廣鹽性生態(tài)類群, 其生活水溫為 6～31℃, 適鹽范圍為 12～35, 其生存空間范圍大, 可以在棲息地漁場(chǎng)及鄰近大部分海域移動(dòng)生存[28]。

群體的NJ進(jìn)化樹(shù)顯示, 皮口、綏中和青島3個(gè)群體聚為一支, 廣州與粵東(深圳和汕尾)群體聚為另一支。5個(gè)群體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系在一定程度上是由群體的地理位置分布情況決定的, 廣州在地理位置上與粵東的深圳和汕尾相近, 而與皮口、綏中、青島3個(gè)海域相距甚遠(yuǎn), 這與本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的 NJ進(jìn)化樹(shù)結(jié)果相一致, 展現(xiàn)了廣州群體與其他 3個(gè)群體間較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。從單倍型進(jìn)化樹(shù)上也可以看出皮口、綏中和青島 3個(gè)群體的單倍型嵌套聚集形成一支,沒(méi)有形成明顯的地理分化格局, 而廣州群體特有單倍型獨(dú)立形成另一支, 說(shuō)明廣州群體與其他 3個(gè)群體間具有顯著的遺傳分化。口蝦蛄群體所有單倍型形成的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖也顯示出廣州群體與皮口、綏中和青島3個(gè)海域的口蝦蛄群體間大的遺傳分化,結(jié)果與單倍型的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)一致。

在線粒體基因組序列中, 受選擇壓力的不同而導(dǎo)致各個(gè)區(qū)域進(jìn)化速率的不同。如 D-Loop 由于不編碼蛋白質(zhì)受到的選擇壓力少, 所以進(jìn)化速度較快,比較適用于群體遺傳學(xué)及近緣種間的分析研究[30]。16S rRNA、12S rRNA及CO氧化酶亞單位等適用于種屬間至科級(jí)以下分類階元的探討[31-32]。COI與Cytb進(jìn)化速率適中, 適合種群水平差異的研究[33]。

基于對(duì)口蝦蛄線粒體COI序列的檢測(cè), 了解口蝦蛄的遺傳多樣性后, 有助于對(duì)其野生資源制定具體的科學(xué)的保護(hù)措施。本研究獲得的遺傳多樣性較好的廣州種群, 遺傳多樣性相對(duì)較低的皮口、綏中和青島種群, 為以后口蝦蛄的科學(xué)育苗、野生種質(zhì)資源保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用提供了新的依據(jù)。作者測(cè)定的口蝦蛄COI序列豐富了GenBank報(bào)道的同種同源序列, 提供了更多可供研究的基因片段。今后, 可再進(jìn)行COI作為DNA條形碼對(duì)蝦蛄科進(jìn)行物種識(shí)別的可行性的探討[34]。

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