辣椒素誘導人腎癌細胞凋亡及其機制的研究

劉濤 陶皇恒 王剛 方志海 楊中華 王行環(huán) 周家杰

腎細胞癌是腎腫瘤中最常見的病理類型（約占 原發(fā)性腎惡性腫瘤的90%），位居泌尿系腫瘤第2位（僅次于膀胱癌），占全身惡性腫瘤的2%～3%［1］。早期腎癌預后較好，保留腎單位腎部分切除術和腎癌根治性切除術往往能取得較好的療效。遺憾的是，腎癌臨床表現多變而隱匿，早期不易發(fā)現，實際上約1／3的患者在獲得確診時已經發(fā)展為腎癌晚期［1］。而另一方面，腎癌對常規(guī)放化療均不敏感，導致腎癌（尤其是晚期腎癌）的臨床治療方案相對缺乏［2-3］。因此，尋找新的、安全而有效的抗腎癌藥物迫在眉睫。

辣椒素是辣椒等辛辣食物的主要有效成分，是一種香草酰胺類衍生物，其化學結構式為8-甲基-N-香草基-6壬烯基酰胺（C18H27NO3）。辣椒素對多種疾?。ㄈ缣弁矗?］、皮膚病［5］、關節(jié)炎［6］等）具有廣泛治療效果，其抗癌效果也日益受到關注。但截至目前為止，尚未有文獻報道辣椒素對腎癌細胞的作用效果及機制，因此，本課題組研究辣椒素誘導腎癌786-O細胞凋亡及相關分子機制，以探討辣椒素作為抗腎癌藥物的潛能。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)

人腎癌細胞株786-O（購自 ATCC）用含10%血清，100IU／ml青霉素和100μg／ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)（均購至Gibco公司）。

二、MTT檢測

按照試劑盒（Corning Incorporated公司）說明書逐步操作：786-O細胞以5×103的密度種在96孔板中，用不同濃度的辣椒素（使用抑制劑辣椒平時，抑制劑較辣椒素提前2h使用，濃度為2μmol／L）處理，每組設置10個孔。分別孵育12、24和48h后，棄去液體，加入20μl的 MTT （5mg／ml，Sigma公司），37℃下孵育4h。然后小心除去上清，加入150μl DMSO。490nm下測定吸光度。

三、活性氧檢測

按照活性氧試劑盒（碧云天生物科技有限公司，南通）說明書：先將786-O細胞種植于96孔板（每孔1×104細胞），用不同濃度的辣椒素（使用抑制劑辣椒平時，抑制劑較辣椒素提前2h使用，濃度為2μmol／L）處理24h，然后更換培養(yǎng)液為含有終濃度為10μmol／L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)液，避光孵育20min。再用無血清培養(yǎng)液清洗3遍，熒光酶標板讀數。

四、細胞凋亡檢測

常規(guī)培養(yǎng)細胞至50%～70%融合度，加入含不同濃度辣椒素（使用抑制劑辣椒平時，抑制劑較辣椒素提前2h使用，濃度為2μmol／L）的完全培養(yǎng)液。辣椒素孵育達指定時間后，胰酶消化，收集細胞，用含FITC-Annexin V（PharMingen，San Diego，CA）以及PI的緩沖液室溫避光孵育5min，然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。此外，Hochest染色用于顯示凋亡形態(tài)學變化。前期處理同流式細胞實驗，辣椒素處理后，更換培養(yǎng)液為含有10μmol／L Hochest 33258染料的PBS，避光孵育30min，充分洗滌后再倒置熒光顯微鏡下觀察。

五、RT-PCR

786-O細胞總RNA用TRIzol（Invitrogen公司）提取，按反轉錄試劑盒（Thermo scientific公司）的說明進行反轉錄。轉錄條件：預變性94℃／2min；變性94℃／30s，退火60℃／30s，延伸72 ℃／60s，35 個 循 環(huán)；延 伸 72 ℃／10min。TRPV1上游引物：5′-TTCCGA GGG ATT CAG TAT TT-3′；下游引物：5′-TGA GCA GGA GGA TGT AGG TG-3′；內參β-actin上游引物：5′-AGA AGG ATT CCT ATG TGG GCG-3′，下游引物：5′-CAT GTC GTC CCA GTT GGT GAC-3′。

六、Western blot

細胞用PBS洗滌2次，1%Triton裂解緩沖液冰上裂解。BCA法測定蛋白濃度。95℃變性10min后，蛋白樣品在7.5%、10%、12.5%或15%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，將分離的蛋白電轉至PVDF膜。將載有蛋白的PVDF膜用TBST溶液漂洗3次10min，然后與指定抗體共孵育4℃過夜。再次用TBST溶液漂洗3次10min后，與二抗室溫下作用2h。漂洗后用ECL顯色試劑盒顯色，并于暗室內用膠片曝光、顯影及定影。所用抗體如下：抗TRPV1抗體（1∶200，＃ACC-030）購至 Alomone Labs公司（Jerusalem，Israel）；抗 GAPDH 抗體（1∶1 000，sc-166574）購至Santa Cruz Biotechnology公司（USA）；抗FADD抗體（1∶1 000，＃2782），抗caspase-3抗體（1∶500，＃9665），抗caspase-8抗體（1∶1 000，＃9496），抗caspase-9抗體 （1∶1 000，＃9502），均購自 Cell Signaling Technologies公司（Danvers，MA）；抗 Bcl2 （1∶1 000，＃12789-1-AP），抗Bax（1∶1 000，＃50599-2-Ig）購自ProteinTech Group公司（Chicago，USA）；抗c-myc（1∶1 000，＃ab32072）購自 Abcam 公司 （Cambridge，UK）。

七、統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計處理，所有數據以均數±標準差表示。采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、辣椒素抑制細胞增殖

用不同濃度的辣椒素（0、50、100、200、300、400μmol／L）處理786-O細胞，分別檢測藥物作用12、24和48h的細胞存活率。細胞生存率曲線表明，辣椒素以劑量依賴關系和時間依賴關系抑制786-O細胞存活率。如圖1所示，在48h組，與對照組相比，50、100、200、300、400μmol／L辣椒素使786-O細胞生存率分別下降了17.24%、35.10%、58.09%、64.80%。時間依賴性數據顯示，當使用200μmol／L辣椒素處理時，12、24和48h藥物孵育分別降低4.21%、20.72%、58.09%的細胞生存率。

二、辣椒素受體TRPV1在786-O細胞中的表達

通過RT-PCR和Western blot檢測TRPV1在786-O細胞的表達情況。如圖2所示，無論在信使RNA水平還是在蛋白水平，786-O細胞中都檢測到TRPV1表達。陽性對照為2株膀胱癌細胞T24和5637，本課題組前期研究已經證實這2株細胞中TRPV1的表達［7-8］。此外，通過使用TRPV1特異性拮抗劑辣椒平，我們發(fā)現當使用辣椒平預處理786-O細胞時，辣椒素對786-O細胞的增殖抑制效應被顯著削弱，即辣椒平預處理后，400μmol／L辣椒素僅能引起18.39%的增殖抑制率，這甚至低于單獨使用200μmol／L辣椒素的效應（圖1B）。這表明，TRPV1的確參與了辣椒素對786-O細胞的增殖抑制效應。

圖1 辣椒素對786-O細胞的增殖抑制

圖2 TRPV1的表達

三、辣椒素使細胞內活性氧水平升高

活性氧測定結果表明，與對照組相比，100、200和300μmol／L辣椒素分別增加了25.35%、83.74%和162.80%的活性氧水平（圖3）。同樣，辣椒平預處理也能對抗該效應，圖3的數據顯示，辣椒平預處理后，300μmol／L辣椒素僅能引起23.49%的活性氧增加，這僅與單獨使用100μmol／L辣椒素的效應相當。

四、辣椒素誘導786-O細胞凋亡

流式細胞實驗結果表明，100、200和300μmol／L辣椒素處理24h后細胞凋亡率分別為7.11%、11.13%和17.80%，與對照組（凋亡率1.98%）相比差異均有統計學意義（圖4A和4B）。同樣，辣椒平預處理使得辣椒素促凋亡效應也大大減弱，300μmol／L辣椒素單獨處理時凋亡率為17.80%，而加用辣椒平預處理后再用辣椒素時凋亡率僅為7.72%（圖4A和4B）。此外，Hochest染色顯示，辣椒素處理后，786-O細胞內發(fā)生了顯著的核濃縮和核碎裂現象，且凋亡形態(tài)學變化也能被辣椒平減弱（圖4C）。

圖4 辣椒素誘導786-O細胞凋亡及辣椒平對該效應的影響

五、凋亡相關分子的變化

本實驗用Western blot技術檢測具有代表性的凋亡相關分子（包括c-myc、FADD、Bax及caspase-3、-8、-9裂解片段等）表達水平的變化。實驗結果表明，辣椒素處理能顯著促進促凋亡分子c-myc、FADD、Bax等的表達，以及caspase-3、-8、-9等凋亡分子的裂解激活，而降低抗凋亡分子Bcl2的表達水平（圖5）。

圖5 凋亡相關分子的表達變化

討 論

辣椒作為食物調料和傳統藥物已有上千年歷史。流行病學資料顯示，偏食辣味食物的墨西哥人和印度人，其癌癥發(fā)病率遠低于歐美人［9］。辣椒素是辣椒主要活性成分，它作為配體能刺激選擇性鈣通道TRPV1，引起該通道激活釋放Ca2＋流，增加細胞內Ca2＋濃度，從而引發(fā)一系列生理病理變化［10］。辣椒素對風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、糖尿病性神經痛、帶狀皰疹后遺性神經痛及銀屑病等的臨床療效已經得到充分肯定［4-6］。近年來，有關辣椒素抗癌效應的研究在國內外均日益受到關注。研究初步證明辣椒素不僅在體內外對多種腫瘤細胞（如人膀胱癌［7，11］、前列腺 癌［12］、神 經 膠 質 瘤［13］和 胃 癌［14］等）的增殖具有顯著抑制效應，并且破壞線粒體從而引發(fā)腫瘤細胞凋亡，還可以激活機體的抗腫瘤特異性免疫活性，此外還可抑制腫瘤新生血管形成［15］，但對正常健康細胞毒性作用極低［16］。這充分提示，作為一種天然食材成分，辣椒素具有成為新一代廣譜抗腫瘤藥物的潛力。

腎細胞癌對常規(guī)放化療不敏感，這對腎癌（尤其是晚期腎癌）的臨床治療帶來了極大的困難。截至目前為止，辣椒素對腎癌是否有效在國內外文獻中均未見報道。本研究發(fā)現，辣椒素能降低786-O細胞的存活能力，而該抑制效應能被TRPV1拮抗劑辣椒平減弱，說明TRPV1參與了辣椒素786-O細胞的抗增殖效應。更進一步地研究還發(fā)現辣椒素能引起顯著的細胞凋亡，該效應同樣也能被辣椒平部分抵消。辣椒素誘導細胞凋亡的機制可能與促凋亡分子c-myc、FADD、Bax等的表達升高，和caspase-3、-8、-9等凋亡分子的裂解激活，以及抗凋亡分子Bcl2的表達水平下降等有關。辣椒素作為潛在抗腫瘤藥物具有以下4個方面的優(yōu)勢：①辣椒素是天然食材成分，人類上千年的實踐證明其作為食物和藥物的安全性，美國早在1999年就將辣椒素及其同系物（統稱為辣椒素類物質）引入藥典；②辣椒素通過TRPV1介導其抗增殖效應和促凋亡效應，而本研究證實TRPV1在腎癌細胞（786-O細胞）中表達，有可能成為腎癌治療的新靶標；③辣椒素能顯著促進腎癌細胞的凋亡發(fā)生，抑制腫瘤細胞逃逸凋亡途徑，其機制可能為促凋亡分子c-myc、FADD、Bax等的表達升高，和caspase-3、-8、-9等凋亡分子的裂解激活，以及抗凋亡分子Bcl2的表達水平下降；④辣椒素在減輕疼痛方面的作用已經被肯定［4］，基于這一點可以推斷其對減輕晚期腎癌患者的疼痛、提高生存質量方面也可能具有較大的優(yōu)勢。

綜上所述，辣椒素可抑制腎細胞癌786-O細胞的增殖，誘導其凋亡，其抗腫瘤效應有可能受到TRPV1的介導。然而，本研究尚有待完善之處，比如本實驗使用單一細胞系，僅能證明辣椒素對單一細胞有效，而尚不能排除細胞特異性效應。另外，未使用正常腎源性細胞系作為對照，無法強有力證實藥物對腫瘤的選擇性殺傷效應。因此，在本課題組的進一步深入研究中，將對以上不足作更為細致的探討。當然，進一步探討TRPV1在正常腎組織和腎腫瘤組織中的表達差異模式將對腎癌靶向治療提供更加可靠的理論依據。此外，有關辣椒素衍生物對腎癌細胞的抗癌效應（包括對腫瘤發(fā)生、腫瘤細胞周期、腫瘤轉移等方面的影響）及辣椒素誘導腎癌細胞凋亡的信號通路和信號轉導機制有待進一步研究探討。

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