miR-10b在腎癌中的表達及臨床意義研究

胡祎民 金露 李一帆 陳獨群 蘇鄭明 劉家駒 楊尚琪 桂耀庭 毛向明 來永慶

微小 RNA（microRNA，miRNA）是非編碼RNA的一種，長度在20～25個核苷酸左右［1］。因有研究發(fā)現(xiàn)miRNA能夠通過抑制mRNA翻譯或使mRNA降解調(diào)節(jié)基因表達，因此，miRNA近年來成為研究熱點［2］。miRNA在多種重要的細胞生物進程中均發(fā)揮著重要作用，如細胞增殖、細胞遷移、細胞凋亡等［3］。在包括腎癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中均檢測到miRNA的異常表達，基因芯片篩選出了在腎癌組織中表達異常的miRNA［4］。但是，和已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的在乳腺癌［5］、喉癌［6］及肝癌［7］等腫瘤組織中的高表達不同，miR-10b在腎癌組織中表達下調(diào)，因此我們選用miR-10b作為研究對象，驗證其在腎癌組織中的表達水平，探究其在腎癌發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用。

腎細胞癌（renal cell cancer，RCC），簡稱腎癌，起源于近端腎小管，是腎臟腫瘤中最常見的類型［4］。腎癌最常見的組織類型為透明細胞癌，約占腎細胞癌的75%～80%［3］。約30%的患者診斷時已經(jīng)存在遠處轉(zhuǎn)移，由于對放療、化療不敏感，目前腎癌的主要治療方法只有通過外科手術(shù)切除［8］。美國2013年統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明新發(fā)腎癌病例有65 150例，其中有8 780例因腎癌死亡［9］。腎癌發(fā)病早期無典型癥狀，預(yù)后不佳，因此尋找可用于腎癌早期診斷、靶向治療及預(yù)后判斷的生物標志物就尤為重要。

本研究通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測配對組織、腎癌細胞系中miR-10b的相對表達量，分析其表達水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性，探究miR-10b與腎癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

材料與方法

一、標本收集及臨床資料

收集35例腎癌及相應(yīng)的癌旁組織，所取標本均經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者均已簽署知情同意書。標本均由手術(shù)切除，且切除后置于RNA保護液中，24h后轉(zhuǎn)移至-80℃液氮中保存。每對標本包括腎癌組織（顯微鏡檢證實癌細胞80%以上）1例、癌旁組織（手術(shù)切除距腎癌病灶5cm以上，顯微鏡檢提示正常細胞90%以上）1例。所有病例均有完整的臨床資料（見表1），組織分型參考 WHO分類標準，臨床分期參考2009年美國癌癥聯(lián)合會的標準進行。

二、細胞系及細胞培養(yǎng)

人RCC細胞系：786-O、ACHN細胞（美國細胞培養(yǎng)收藏中心，美國）。人胚腎細胞系：HEK-293T（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院培養(yǎng)物收藏中心，中國）。細胞接種于含1%谷氨酰胺、1%抗生素及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放置在37℃，5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

三、總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

在液氮下碾磨標本組織、培養(yǎng)細胞，使用Trizol試劑（Invitrogen，USA）分別提取總 RNA，使用NanoDrop 2000／2000c測定RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑 miScript RT Kit（Qiagen，Germany）說明書所述，取1μg總RNA加入反應(yīng)體系進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)在普通RT-PCR 儀（BIO-RAD，USA）上進行。反應(yīng)程序：37℃60min，95℃5min。

四、qRT-PCR檢測miR-10b水平

根據(jù)miRNA 熒光試劑 miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，Germany）說明書所述，進行qRTPCR反應(yīng)，反應(yīng)在LC 480熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，USA）上進行。miR-10b正向引物由Qiagen公司合成：5′-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3′，反向引物為Qiagen公司試劑盒中提供的通用引物；以U6snRNA作為內(nèi)參照進行標準化處理，U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-ACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95℃15min，94℃15s，55℃30s，70℃30s，共計完成40個循環(huán)。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

按 照 公 式 2-ΔCT（ΔCT ＝ CTmiR-196a-CTU6，ΔΔCT＝ΔCTRCC-ΔCTNormal）計算 miR-10b的相對表達量［10］，2-ΔΔCT即 miR-10b在腎癌及正常組織中表達量比值。采用配對t檢驗分析配對組織間、各細胞系之間miR-10b表達水平差異。將病例資料按年齡、性別、組織類型、臨床分期分組（年齡以中位數(shù)51歲分界），按腎癌組織miR-10b相對表達量平均數(shù)分為高表達組、低表達組，列出四格表，行χ2檢驗探究miR-10b表達水平與患者臨床特征之間的關(guān)系。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-10b在腎癌組織、腎癌細胞系（786-O、ACHN）中表達下調(diào)

采用qRT-PCR檢測組織及細胞系中miR-10b的表達水平，結(jié)果顯示786-O、ACHN腎癌細胞中miR-10b表達水平均低于 HEK-293T（P＜0.05），結(jié)果如圖1所示。在35例腎癌標本中，26例（74.29%）腎癌組織miR-10b表達水平下降，腎癌組織中miR-10b表達水平明顯低于正常組織（P＜0.05），結(jié)果如圖2A所示。通過2-ΔCT計算miR-10b在組織中相對表達量，在腎癌中其均數(shù)±標準誤為0.273 84±0.054 63，結(jié)果如圖2B所示。

二、miR-10b表達水平與病例臨床特征的相關(guān)性

通過χ2檢驗探究miR-10b表達水平與患者臨床特征之間的關(guān)系，結(jié)果如表1所示，未發(fā)現(xiàn)miR-10b表達水平與病例相關(guān)臨床特征之間有相關(guān)性。

圖1 miR-10b在細胞系中的相對表達量

圖2 miR-10b在正常組織及腎癌組織中的表達

表1 miR-10b表達水平與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

討 論

miRNA是一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其在多種細胞生物進程中都扮演著重要的角色［11］。超過半數(shù)的miRNA位于染色體的脆性位點及與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因區(qū)域［12］，這也表明了miRNA在腫瘤發(fā)生中所扮演角色的重要性及復(fù)雜性。miRNA通過和mRNA的3′端不完全性結(jié)合，抑制信使RNA翻譯或使其降解發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用［13］。據(jù)推算，超過60%的編碼基因均受到miRNA的調(diào)控［14］。有研究證實，miRNA和肺癌、頭頸部腫瘤等的預(yù)后相關(guān)，miRNA也有作為腫瘤標志物應(yīng)用于臨床的可能［15］。

miR-10b位于人類2號染色體［4］，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中均有miR-10b的表達升高，且和腫瘤的發(fā)生機制相關(guān)，但尚無miR-10b在腎癌中的功能研究。在乳腺癌中miR-10b的表達是上調(diào)的，且通過抑制miR-10b的表達可以對抗轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）引 起的細胞侵襲、細胞增殖及上皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換，從而可以抑制乳腺癌組織的生長及轉(zhuǎn)移，因此在乳腺癌中 miR-10b是基因治療的可能靶點［5］。miR-10b在鼻咽癌中表達上調(diào)，Allaya等［13］的研究發(fā)現(xiàn)miR-10b通過作用于LMP1及Twist1通路發(fā)揮其作用，且miR-10b的表達水平和鼻咽癌的臨床分級及診斷時年齡相關(guān)，提示其作為生物標志物應(yīng)用于鼻咽癌診斷的可能。Sun等［16］的研究發(fā)現(xiàn)miR-10b可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metal-loprotein9，MMP-9）的表達水平，抑制miR-10b的表達則可以明顯下調(diào)鈣黏蛋白（epithelia cadherin，E-cadherin）的表達水平，從而在鼻咽癌細胞的遷移及侵襲中發(fā)揮重要作用。在肝細胞癌中同樣檢測到miR-10b的高表達，且miR-10b可以通過HOXD10／RhoC／uPAR／MMPs通路調(diào)節(jié)肝癌細胞的遷移和侵襲，因此miR-10b是肝細胞癌靶向治療的靶點選擇之一［7］。在許多腫瘤組織中miR-10b的表達均升高，而在腎癌中檢測到miR-10b的表達下調(diào)，提示miR-10b在腎癌中的作用機制與在其他腫瘤組織中不同，對miR-10b進行研究可能會對腎癌的發(fā)生及發(fā)展機制有所了解，也為腎癌的基因靶向治療提供一個新的選擇。

本研究在腎癌組織及腎癌細胞中驗證了miR-10b的表達水平，結(jié)果證實miR-10b在腎癌組織中表達水平相對配對癌旁正常組織明顯下降，且在腎癌細胞系（786-O、ACHN）中表達水平明顯低于HEK-293T。未發(fā)現(xiàn)miR-10b的異常表達和患者年齡、性別、腎癌組織類型及分期相關(guān)，但這不能排除因樣本數(shù)過少產(chǎn)生的偏倚，需要擴大樣本量進一步驗證。

目前關(guān)于miRNA功能研究的方法已較成熟。下一步的實驗將收集更多組織標本驗證其表達水平及miR-10b和患者臨床病理特征之間的關(guān)系，進而將miR-10b功能類似物及抑制物分別轉(zhuǎn)染到細胞中，通過觀察細胞增殖、遷移、凋亡等一系列生物進程探究miR-10b對腎癌細胞的功能調(diào)節(jié)，最后通過熒光素酶、蛋白質(zhì)印跡等實驗尋找miR-10b在腎癌細胞中的靶基因。

總之，腎癌組織及細胞中miR-10b的表達水平下調(diào)，提示其對于腎癌的發(fā)生及發(fā)展機制研究有一定意義，為腎癌靶向治療提供了一個新的選擇。但目前尚無miR-10b在腎癌中的功能研究報道，本研究為后續(xù)miR-10b的功能及作用機制研究奠定了基礎(chǔ)。

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