靶向抑制EGFR核轉(zhuǎn)位對鼻咽癌細(xì)胞輻射耐受相關(guān)分子DNA-PK活化的作用*

馬士淇，李 璐，劉惠芬，郎錦義，黃建鳴

(四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，成都 610041)

鼻咽癌是我國南方地區(qū)的一種常見惡性腫瘤。目前主要治療方法有放療、手術(shù)、化療等，其中放療是首選治療手段。但患者放療后5年生存率僅為40%～50%，因而針對于鼻咽癌放射敏感性的研究引起臨床的重視。人類表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因 cerbB-1(HER-1)表達(dá)產(chǎn)生的一種酪氨酸激酶受體，研究表明在鼻咽癌細(xì)胞中EGFR存在大量表達(dá)，并和鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系［1］。傳統(tǒng)的受體學(xué)說認(rèn)為，EGFR是細(xì)胞膜受體，然而近年來在皮膚癌及肺癌等細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)電離輻射、熱休克、H2O2等應(yīng)激條件能夠激活EGFR并通過磷酸化其核定位信號序列(nuclear localization signal，NLS)上Thr654與輸入素α和β相互作用而進(jìn)入細(xì)胞核，在核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。在這些新的功能中，核EGFR促進(jìn)應(yīng)激情況下如電離輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂(double strands breaks，DSBs)的修復(fù)尤其重要。在高等真核生物中，非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)在修復(fù)放療介導(dǎo)的DNA損傷中扮演關(guān)鍵角色。NHEJ依賴于DNA依賴性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)。研究發(fā)現(xiàn)DNA-PK Thr2609的磷酸化對其在NHEJ中發(fā)揮作用至關(guān)重要，核EGFR可以通過與DNA-PK形成復(fù)合物影響其在細(xì)胞中的分布并作為一種蛋白激酶磷酸化DNA-PK Thr2609位殘基，激活DNA-PK在NHEJ中發(fā)揮作用［2］。而這種作用機(jī)制在鼻咽癌治療耐受研究中鮮有報(bào)道?；贓GFR與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系，本研究考察了輻射對鼻咽癌細(xì)胞EGFR核轉(zhuǎn)位的影響，并初步探討EGFR核轉(zhuǎn)位抑制肽對鼻咽癌細(xì)胞輻射耐受相關(guān)分子DNA-PK表達(dá)的作用及其潛在的分子關(guān)聯(lián)機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株購自上海細(xì)胞庫，用含10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1．2 合成抑制肽

設(shè)計(jì)并合成與EGFR上的核定位序列(EGFRNLS)的序列相似性磷酸化多肽［Ac-RKRT(PO3H2)LRRLK］作為競爭抑制EGFR核轉(zhuǎn)位的干擾藥物，同時設(shè)計(jì)對照多肽(KKALRRQEAVNAL)，純度 ＞98%，上海楚肽生物科技有限公司。

1．3 輻射處理

取指數(shù)生長期的細(xì)胞在pT654抑制肽及對照肽(5μM)作用16h后，采用60Co γ射線照射，輻射4Gy后，將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取蛋白。細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白的提取采用細(xì)胞核和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(上海生工BSP001)。

1．4 Western blot檢測

考馬斯亮藍(lán)染液測定蛋白濃度，上樣，根據(jù)蛋白分子量進(jìn)行不同濃度SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移通過半干轉(zhuǎn)印到固相支持體 PVDF膜上，用5%脫脂奶粉的TBST 37℃封閉1 h，分別孵育一抗:兔抗人GAPDH單克隆抗體(1∶20 000)(Epitmics)、兔抗人 Lamin B1單克隆抗體(1∶20 000)(Epitmics)、鼠抗人EGFR單克隆抗體(1∶5 000)(BD Biosciences)，兔抗人pEGFRThr654單克隆抗體(1∶100)(Millipore)、小鼠抗人DNA-PKcs單克隆抗體(1∶2 500)(Epitmics)、小鼠抗人pDNA-PKcsThr2609單克隆抗體(1 ∶1 000)(Abcam)，4℃ 過夜;TBST漂洗10min，3次，孵育二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/鼠IgG(H+L)(中杉金橋)，37℃孵育l h;TBST漂洗10 min，3次;eECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒曝光顯影(北京康為世紀(jì));曝光后底片上蛋白條帶計(jì)算吸光度，分析蛋白的相對表達(dá)量。

1．5 相關(guān)性分析

應(yīng)用 SPSS 19．0軟件對 pEGFRThr654和 pDNAPKThr2609的蛋白表達(dá)值進(jìn)行相關(guān)性分析(Spearman)，計(jì)算線性擬合的相關(guān)系數(shù)R2值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19．0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(±s)，兩組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 放射后鼻咽癌細(xì)胞質(zhì)中EGFR相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示CNE-1細(xì)胞在4Gy照射后0～40min內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)中EGFR及pEGFRThr654表達(dá)呈時間依賴性增加，其中照射后40min時，CNE-1細(xì)胞質(zhì)中pEGFRThr654表達(dá)量較0 min時升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，圖1B)。

2．2 放射后鼻咽癌細(xì)胞核中EGFR及DNA-PK相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示CNE-1細(xì)胞在4Gy照射后0～40min內(nèi)，細(xì)胞核中EGFR和pEGFRThr654表達(dá)以及DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白pDNA-PKThr2609表達(dá)均呈時間依賴性增加，各時間點(diǎn)蛋白表達(dá)量與相應(yīng)0min時比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，圖2B)。在各組核蛋白樣本中，未檢測到胞質(zhì)蛋白內(nèi)參GAPDH表達(dá)，證實(shí)核蛋白提取過程中無胞質(zhì)蛋白污染(結(jié)果未顯示)。

2．3 核轉(zhuǎn)位抑制肽對CNE-1細(xì)胞核中EGFR及DNA-PK相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示CNE-1細(xì)胞經(jīng)過EGFR核轉(zhuǎn)位抑制肽預(yù)處理后，核內(nèi)EGFR及pEGFRThr654表達(dá)量在照射后10 min時呈現(xiàn)少量增加，然后隨時間延長逐漸降低，其中照射后20 min和40 min時，細(xì)胞核中EGFR和pEGFRThr654表達(dá)量較0 min時降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，圖3B);而經(jīng)過相同濃度及時間預(yù)處理的對照肽組，細(xì)胞核中EGFR及pEGFRThr654蛋白表達(dá)量隨放射后時間延長而逐漸升高。各組pDNA-PKThr2609表達(dá)呈現(xiàn)出與pEGFRThr654表達(dá)相同的趨勢(圖3B)。

圖1 放射后不同時間點(diǎn)CNE-1細(xì)胞質(zhì)中EGFR相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖2 放射后不同時間點(diǎn)CNE-1細(xì)胞質(zhì)中EGFR及DNA-PK相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖3 多肽處理放射后不同時間CNE-1細(xì)胞核中EGFR及DNA-PK相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2．4 pEGFRThr654和 pDNA-PKThr2609的蛋白表達(dá)值相關(guān)性分析

CNE-1細(xì)胞核中pEGFRThr654表達(dá)量隨放射后時間延長逐漸增加，DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白pDNAPKThr2609表達(dá)量隨放射后時間延長逐漸增加，且與pEGFRThr654表達(dá)量呈正相關(guān)(R2=0．935，圖 4A);CNE-1細(xì)胞經(jīng)過EGFR核轉(zhuǎn)位抑制肽預(yù)處理后，核內(nèi)pEGFRThr654表達(dá)量隨放射后時間延長而逐漸降低，同時核內(nèi)pDNA-PKThr2609的表達(dá)也相應(yīng)降低(R2=0．962，圖4B)。

圖4 pEGFRThr654和pDNA-PKThr2609的蛋白表達(dá)值相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

EGFR在許多人類惡性腫瘤中存在過表達(dá)或突變，參與腫瘤發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)變過程。研究報(bào)道EGFR在鼻咽癌組織中高表達(dá)，是評估鼻咽癌進(jìn)展和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)［3］。傳統(tǒng)的受體學(xué)說認(rèn)為，EGFR為細(xì)胞膜受體，作為第一信使，不能進(jìn)入細(xì)胞核，但近年來的研究對該觀點(diǎn)發(fā)出挑戰(zhàn)，目前已在許多腫瘤組織(如乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等)細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)高水平的EGFR 表達(dá)［4-8］。

研究報(bào)道鼻咽癌細(xì)胞中EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1可以通過配體非依賴型方式調(diào)控EGFR核轉(zhuǎn)位，在細(xì)胞核中EGFR與STAT3相互作用，調(diào)節(jié)一系列與腫瘤侵襲性生物學(xué)行為相關(guān)的癌基因的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖［9］。由此可知，核EGFR參與鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展。鼻咽癌目前以放射治療作為主要治療策略，研究發(fā)現(xiàn)放療可介導(dǎo)EGFR胞內(nèi)近膜端核定位信號序列(NLS)上Thr654的磷酸化，通過核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入細(xì)胞核，該位點(diǎn)在EGFR家族成員中具有高度保守性，將其刪除能夠增加放化療敏感性［2］。Dittmann 等［10］以肺癌細(xì)胞為模型發(fā)現(xiàn)放射誘導(dǎo)EGFR進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA雙鏈斷裂非同源末端連接修復(fù)(NHEJ)途徑的關(guān)鍵蛋白DNA依賴蛋白激酶(DNA-PK)相互作用并作為一種蛋白激酶磷酸化DNA-PK Thr2609位殘基［11］，使細(xì)胞具有促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的功能，在放療抵抗中發(fā)揮作用。而DNA損傷修復(fù)應(yīng)答途徑的激活同樣是鼻咽癌輻射抵抗的原因之一［12］?；谀壳瓣P(guān)于EGFR在鼻咽癌細(xì)胞受輻射后在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的活化分布細(xì)節(jié)，以及EGFR轉(zhuǎn)運(yùn)入核后與腫瘤輻射耐受相關(guān)分子的表達(dá)情況尚未有報(bào)道。本研究檢測了輻射后EGFR在鼻咽癌細(xì)胞中的分布變化以及其與細(xì)胞輻射抵抗間的關(guān)系。

本研究選取鼻咽癌細(xì)胞中EB病毒陰性的CNE-1細(xì)胞作為研究對象，通過檢測輻射后不同時間點(diǎn)細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞中EGFR呈高表達(dá)狀態(tài)，輻射處理后早期即可在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中檢測到EGFR及pEGFRThr654的表達(dá)，且 EGFR及 pEGFRThr654的表達(dá)均隨處理時間延長而呈增加趨勢，類似的現(xiàn)象已在肺癌及乳腺癌等相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道過［13-14］，因而我們初步推測EGFR核轉(zhuǎn)位可能是EGFR過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞經(jīng)輻射后的普遍應(yīng)激反應(yīng)，為早期事件，在細(xì)胞核中通過激活不同靶點(diǎn)而為腫瘤細(xì)胞輻射耐受提供可能。同時，我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞在無輻射處理情況下，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中存在基礎(chǔ)水平pEGFRThr654的表達(dá)，我們分析在細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中含有多種激素類因子，其中包括EGF，激活EGFR配體依賴途徑，導(dǎo)致細(xì)胞在無輻射條件下存在pEGFRThr654，具體原因需進(jìn)一步研究。此外，本研究考察了CNE-1細(xì)胞內(nèi)核EGFR與DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白DNAPK之間的聯(lián)系，結(jié)果證實(shí)了隨pEGFRThr654表達(dá)量增加，核內(nèi)EGFR發(fā)生聚集，pDNA-PKThr2609的表達(dá)隨即增加，二者呈現(xiàn)正相關(guān)性，揭示核EGFR激活DNA損失修復(fù)相關(guān)蛋白DNA-PK是其介導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞輻射抵抗的機(jī)制之一。因此，阻斷EGFR核轉(zhuǎn)位將是降低由DNA-PK磷酸化介導(dǎo)的鼻咽癌放療抵抗的重要抑制靶點(diǎn)。

研究表明，核EGFR的促進(jìn)細(xì)胞生成和促進(jìn)放療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞DNA損傷后修復(fù)功能，是造成腫瘤細(xì)胞放療抵抗的重要原因之一。因而針對核內(nèi)EGFR的分子靶向治療具有重要的實(shí)際意義，如阻斷EGFR核運(yùn)輸、或阻斷核內(nèi)EGFR下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將成為有效的新的治療策略。西妥昔單抗(Cetuximab，C225)，是人鼠嵌合單克隆抗體，被認(rèn)為是抑制EGFR受體激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及誘導(dǎo)受體內(nèi)吞和下調(diào)的藥物，有研究認(rèn)為C225可以抑制EGFR核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而降低細(xì)胞核內(nèi)DNA-PK的活性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放療敏感度［15］，但在多種核EGFR高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)C225可激發(fā)EGFR核轉(zhuǎn)位并可能引起耐藥［15-18］，導(dǎo)致 C225在EGFR核轉(zhuǎn)位中觀點(diǎn)矛盾的原因可能與不同因素誘導(dǎo)EGFR磷酸化位點(diǎn)不同有關(guān)。相對于蛋白質(zhì)類大分子藥物，肽類藥物在人體中的作用已引起科學(xué)界的高度重視。小分子的腫瘤抑制肽具有結(jié)構(gòu)易于改造，人工化學(xué)合成的生產(chǎn)成本較低，可以多種方式給藥，不易引起免疫反應(yīng)等特點(diǎn)。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)EGFR的核定位序列(NLS)中Thr654磷酸化在放療介導(dǎo)的EGFR通過核質(zhì)蛋白途徑入核中具有關(guān)鍵作用，選擇Thr654磷酸化的短肽(RKRT(PO3H2)LRRLK)可作為與EGFR上的NLS競爭核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白結(jié)合位點(diǎn)的抑制分子，有效阻斷EGFR核轉(zhuǎn)位［2］。本研究分別觀察抑制肽及對照肽對輻射誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞內(nèi)EGFR核轉(zhuǎn)位的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在輻射早期經(jīng)過抑制肽處理的細(xì)胞核中EGFR及pEGFRThr654蛋白表達(dá)呈現(xiàn)少量增加趨勢，隨后逐漸降低。我們推測抑制肽在預(yù)處理細(xì)胞16h中，與細(xì)胞質(zhì)中基礎(chǔ)水平的pEGFRThr654競爭與輸入素α結(jié)合，在放射初期，隨著細(xì)胞質(zhì)中EGFR Thr654磷酸化水平增加，抑制肽與輸入素α的結(jié)合平衡受到影響，發(fā)生少量核轉(zhuǎn)位，或者EGFR也可通過非NLS與輸入素結(jié)合途徑發(fā)生核轉(zhuǎn)位，具體原因需進(jìn)一步研究。通過觀察總體趨勢，我們認(rèn)為抑制肽能夠有效抑制EGFR核轉(zhuǎn)位及其入核后的DNA修復(fù)相關(guān)活動。因此，通過阻斷pEGFRThr654介導(dǎo)的入核通路，可以實(shí)現(xiàn)靶向抑制EGFR核轉(zhuǎn)位，降低DNA-PK參與的DNA損傷修復(fù)作用，增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性。

綜上，我們初步得出結(jié)論認(rèn)為:輻射能夠誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞內(nèi)EGFR核轉(zhuǎn)運(yùn)，并且EGFR核轉(zhuǎn)運(yùn)可能由T654位殘基磷酸化介導(dǎo)并和DNA損傷修復(fù)等輻射耐受作用相關(guān)。通過靶向阻斷EGFR的核轉(zhuǎn)位可以消除EGFR-DNA-PK復(fù)合物的相互作用，抑制DNA損傷修復(fù)，減少細(xì)胞的存活。鑒于EGFR在多種腫瘤中高表達(dá)，這種機(jī)制可能具有腫瘤組織或細(xì)胞特異性，是一種非常有前景的治療靶點(diǎn)，開發(fā)靶向EGFR或其下游信號的阻斷劑聯(lián)合放化療一體化治療有重要的臨床意義和應(yīng)用前景。

［1］ Kim ES，Khuri FR，Herbst RS．Epidermal growth factor receptor biology(IMC-C225)［J］．Curr Opin Oncol，2001，13(6):506-513．

［2］ Dittmann K，Mayer C，F(xiàn)ehrenbacher B，et al．Nuclear EGFR shuttling induced by ionizing radiation is regulated by phosphorylation at residue Thr654［J］．FEBS Lett，2010，584(18):3878-3884．

［3］ Pan J，Kong L，Lin S，et al．The clinical significance of coexpression of cyclooxygenases-2，vascular endothelial growth factors，and epidermal growth factor receptor in nasopharyngeal carcinoma［J］．Laryngoscope，2008，118(11):1970-1975．

［4］ Traynor AM，Weigel TL，Oettel KR，et al．Nuclear EGFR protein expression predicts poor survival in early stage non-small cell lung cancer［J］．Lung Cancer，2013，81(1):138-141．

［5］ Xia W，Wei Y，Du Y，et al．Nuclear expression of epidermal growth factor receptor is a novel prognostic value in patients with ovarian cancer［J］．Mol Carcinog，2009，48(7):610-617．

［6］ Muthusami S，Prabakaran DS，Yu JR，et al．FTS is responsible for radiation-induced nuclear phosphorylation of EGFR and repair of DNA damage in cervical cancer cells［J］．J Cancer Res Clin Oncol，2015，141(2):203-210．

［7］ Lo HW，Xia W，Wei Y，et al．Novel prognostic value of nuclear epidermal growth factor receptor in breast cancer［J］．Cancer Res，2005，65(1):338-348．

［8］ Psyrri A，Yu Z，Weinberger PM，et al．Quantitative determination of nuclear and cytoplasmic epidermal growth factor receptor expression in oropharyngeal squamous cell cancer by using automated quantitative analysis［J］．Clin Cancer Res，2005，11(16):5856-5862．

［9］ Xu Y，Shi Y，Yuan Q，et al．Epstein-Barr Virus encoded LMP1 regulates cyclin D1 promoter activity by nuclear EGFR and STAT3 in CNE1 cells［J］．J Exp Clin Cancer Res，2013，32(1):90．

［10］ Dittmann K，Mayer C，Rodemann HP．Inhibition of radiation-induced EGFR nuclear import by C225(Cetuximab)suppresses DNA-PK activity［J］．Radiother Oncol，2005，76(2):157-161．

［11］ Liccardi G，Hartley JA，Hochhauser D．EGFR nuclear translocation modulates DNA repair following cisplatin and ionizing radiation treatment［J］．Cancer Res，2011，71(3):1103-1114．

［12］ Hennequin C，Quero L，F(xiàn)avaudon V．DNA repair and tumour radiosensitivity:focus on ATM gene［J］．Bull Cancer，2011，98(3):239-246．

［13］ Dittmann K，Mayer C，F(xiàn)ehrenbacher B，et al．Radiation-induced epidermal growth factor receptor nuclear import is linked to activation of DNA-dependent protein kinase［J］．J Biol Chem，2005，280(35):31182-31189．

［14］ Lin SY，Makino K，Xia W，et al．Nuclear localization of EGF receptor and its potential new role as a transcription factor［J］．Nat Cell Biol，2001，3(9):802-808．

［15］ Huang WC，Chen YJ，Li LY，et al．Nuclear translocation of epidermal growth factor receptor by Akt-dependent phosphorylation enhances breast cancer-resistant protein expression in gefitinib-resistant cells［J］．J Biol Chem，2011，286(23):20558-20568．

［16］ Li C，Iida M，Dunn EF，et al．Nuclear EGFR contributes to acquired resistance to cetuximab［J］．Oncogene，2009，28(43):3801-3813．

［17］ Wheeler DL，Huang S，Kruser TJ，et al．Mechanisms of acquired resistance to cetuximab:role of HER(ErbB)family members［J］．Oncogene，2008，27(28):3944-3956．

［18］ Brand TM，Iida M，Luthar N，et al．Nuclear EGFR as a molecular target in cancer［J］．Radiother Oncol，2013，108(3):370-377．