星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化鳳尾草總黃酮超聲提取工藝

周國(guó)梁，劉小胖，俞 浩 ，劉漢珍，郭元新，馬世堂

(1.安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038;3.溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000）

鳳尾草為鳳尾蕨科植物鳳尾草(Pteris multifida Poir)的干燥全草，主要功效為清熱解毒，涼血止血，消腫解毒[1]。鳳尾草中的成分較多，其中主要含黃酮類、萜類、甾醇類等化學(xué)成分。根據(jù)近年文獻(xiàn)報(bào)道表明，鳳尾草中黃酮類化合物在抗菌、抗病毒和抗腫瘤等方面具有明顯活性，因此對(duì)其研究具有一定的研究?jī)r(jià)值[2]。均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)是對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中常用的的工藝優(yōu)化方法，但這兩種方法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)方面精度不夠，不能有效進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合[3]，星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中具有較高的精確性，采用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體的效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化試驗(yàn)條件，該方法使用簡(jiǎn)便，結(jié)果分析較為精確，具有很高的應(yīng)用性。本研究旨在利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化鳳尾草中總黃酮提取工藝，為其提取工藝研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

TU－1810PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);JA3003電子天平(上海方瑞精密儀器有限公司);SHB－A96型循環(huán)多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);KQ－250型超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)。使用所有試劑均為分析純;水為自制蒸餾水;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):100080－201309)。

1.2 藥材

鳳尾草(Pteris multifida Poir)購(gòu)自安徽亳州滬譙飲片廠(批號(hào):20130615)，經(jīng)中藥實(shí)驗(yàn)室劉漢珍副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 鳳尾草總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 藥材的處理 鳳尾草在60～70℃烘箱中恒溫干燥3～4h，粉碎過(guò)40目篩，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.00mg，置于10mL容量瓶中，采用參考文獻(xiàn)方法[3]制定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蘆丁對(duì)照品濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:A=11.72634C －0.07716，r=0.9995，蘆丁在10.0 ～65.0μg/mL 范圍內(nèi)其濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.3 鳳尾草中總黃酮成分的提取 精密稱取5份鳳尾草粉末各2.00g，置100mL錐形瓶中，在一定乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比條件下超聲波輔助提取，提取液離心后，抽濾除渣，得提液后，按照2.1.2中的方法測(cè)定鳳尾草中總黃酮含量，并計(jì)算提取率。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)做3次，取平均值。

總黃酮提取率(%)=樣品溶液中的總黃酮量/樣品重×100%

2.1.4 精密度考察 精密吸取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照2.1.2條件下連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度，計(jì)算RSD為1.35%。

2.1.5 樣品穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，在0、1、2、4、6 h按照2.1.2條件下分別測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD為1.33%(n=6)，表明樣品溶液在6小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定已知含量的鳳尾草樣品2.00g，置9個(gè)50ml的錐形瓶中，精密加入濃度為 0.238mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液 1.0、1.0、1.0、2.0、2.0、2.0、3.0、3.0、3.0mL，作為高、中、低濃度回收率測(cè)定用樣品，按2.1.3下方法制備，依照2.1.2下測(cè)定方法測(cè)定吸光度并計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為 98.10%，RSD=1.7%(n=6)，表明方法準(zhǔn)確良好。

2.2 單因素提取條件的選擇[4－5]

2.2.1 乙醇濃度的選擇 精密稱取5份鳳尾草粉末各2.00g，置于100 mL錐形瓶中，分別加入40%、50%、60%、70%、80%和90%濃度的乙醇溶液80mL，加熱溫度為25℃，超聲提取30min。提取液離心，抽濾除渣，得粗提液后，按照2.1.3中的方法測(cè)定鳳尾草中總黃酮含量，并計(jì)算提取率。結(jié)果如圖1所示。

從圖1分析可以看出，鳳尾草中總黃酮提取率并不隨乙醇濃度的升高而增加。在乙醇濃度為60%時(shí)，總黃酮提取率出現(xiàn)峰值，之后開始下降。因此確定提取鳳尾草總黃酮乙醇提取濃度范圍為40% ～70%。

2.2.2 提取時(shí)間的選擇 精密稱取5份鳳尾草粉末各2.00g，置于100 mL錐形瓶中加入60%乙醇溶液80mL，加熱溫度為25℃，超聲提取時(shí)間分別5、10、15、20、25、30min。提取液離心，抽濾除渣，得粗提液后，按照2.1.3中的方法進(jìn)行鳳尾草中總黃酮含量測(cè)定，并計(jì)算提取率。結(jié)果如圖2所示。

從圖2分析可以看出，鳳尾草中總黃酮提取率并不隨提取時(shí)間的增加而增加。在提取時(shí)間為20min后，鳳尾草中總黃酮提取率變化不大。因此確定提取總黃酮的最佳提取時(shí)間范圍為10min到30min。

2.2.3 液料比的選擇 精密稱取5份鳳尾草粉末各2.00g，置于100 mL錐形瓶中，分別加入20、40、60、80和100mL濃度為60%的乙醇溶液，加熱溫度為25℃，超聲提20min。提取液離心，抽濾除渣，得粗提液后，按照2.1.3中的方法進(jìn)行鳳尾草中總黃酮含量測(cè)定，并計(jì)算提取率。結(jié)果如圖3所示。

當(dāng)液料比為10到40倍數(shù)時(shí)，隨液料比的增加，鳳尾草中總黃酮提取率也隨之增加，在液料比為50倍時(shí)，鳳尾草中總黃酮提取率開始下降，所以料液比最佳范圍選為20～60倍數(shù)。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.3.1 因素水平設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，乙醇濃度(%)(X1)、提取時(shí)間(min)(X2)及液料比(倍數(shù))(X3)為考察因素設(shè)計(jì)因素水平表[6－10]，設(shè)計(jì)并建立因素水平表見(jiàn)表1。

表1 因素水平表Table 1 Table of factors and levels

2.3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)分組及結(jié)果 根據(jù)試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)，按照表1進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)分組及結(jié)果Table 2 Composite design experimental group table and result

2.3.3 模型建立及顯著性檢驗(yàn) 根據(jù)表2結(jié)果，利用Design Expert 8.0軟件，以總黃酮提取率為指標(biāo)(Y)，采用線性多元回歸和二項(xiàng)式方程對(duì)(X1、X2、X3)因素進(jìn)行擬合，得出擬合方程如下:

線性多元回歸方程:

多元線性回歸R2=0.8428，P=0.4395＞0.01，結(jié)果分析擬合效果不佳，因此線性模型不能采用，故采用二項(xiàng)式方程進(jìn)行擬合。

二項(xiàng)式方程:

對(duì)建立模型進(jìn)行回歸模型分析，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果分析顯示該模型具有顯著性(P＜0.01)，失擬項(xiàng)不顯著以及模擬相關(guān)性較好R2=0.8784，該方程擬合度和可信度均良好，誤差較小，故可用采用此模型對(duì)鳳尾草總黃酮的提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型分析Table 3 The fitted value and F value P

采用F檢驗(yàn)對(duì)二項(xiàng)式方程中的各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)后，簡(jiǎn)化方程，刪除不顯著因素，簡(jiǎn)化后方程R2增加，故可以采用簡(jiǎn)化方程，簡(jiǎn)化方程為:

2.3.4 效應(yīng)面法優(yōu)選工藝條件 應(yīng)用Deseign Expert 8.0軟件制作三維曲面，以鳳尾草中總黃酮提取率為考察量，從三個(gè)變量中選擇一個(gè)為不變量與另兩個(gè)影響因素?cái)M合為三維曲面圖，以擬合目標(biāo)函數(shù)建立數(shù)學(xué)模型，繪制考察量曲面如下圖6－8，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)簡(jiǎn)化后的二項(xiàng)式模型預(yù)測(cè)分析，鳳尾草總黃酮提取率最大值為1.831%，最優(yōu)工藝為:乙醇濃度為63.70%，提取時(shí)間25.80min，液料比44.47倍。

2.3.5 最佳提取工藝的驗(yàn)證 按照優(yōu)選出的鳳尾草最佳提取工藝制備鳳尾草樣品溶液，即乙醇濃度63.7%，提取時(shí)間25.8min，液料比44.47倍，做3組平行試驗(yàn)，結(jié)果平均值與擬合方程預(yù)測(cè)值相比較，見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)預(yù)測(cè)值與實(shí)際值Table 5 Verification experiment predicted and actual values

驗(yàn)證得到實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的偏差率為－0.928%，偏差較小，表明預(yù)測(cè)值較為準(zhǔn)確，模型預(yù)測(cè)性較好。

3 討論

星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化主要需要依靠合理的包括最佳試驗(yàn)條件的試驗(yàn)范圍，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中為了得到合理的較優(yōu)的試驗(yàn)條件，首先進(jìn)行了單因素條件考察，確定了優(yōu)化條件的范圍，因此在使用星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法之前，建立合理的試驗(yàn)各因素與水平非常重要[11]。

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法克服了以往正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)的缺陷，通過(guò)采用非線性擬合的中心組合－效應(yīng)面法研究各因素間相互作用的一種回歸分析方法。該法采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，在試驗(yàn)過(guò)程中能夠以中心點(diǎn)為中心，連續(xù)進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)不斷提高試驗(yàn)精度，因此復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，結(jié)果顯示預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值[12]。

在提取方法中，本試驗(yàn)采用超聲波提取法，主要是利用超聲波產(chǎn)生振動(dòng)能夠引起強(qiáng)烈空化效應(yīng)和攪拌作用，使藥材植物細(xì)胞破裂，藥材細(xì)胞中成分能夠快速滲透到溶劑之中，加速了藥材中的有效成分溶出，提取時(shí)間縮短，提取效率大幅增加。該法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，使用操作方便，并且在提取過(guò)程中溫度較低，能夠防止黃酮類成分的氧化分解，所以比較適合該類成分的提取[13]。

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