雪蓮培養(yǎng)物高效液相色譜指紋圖譜研究

賈康杰 ，馬昆鵬，高麗華，邵勇，方均建，董芳霆，胡顯文

1.山西康寶生物制品股份有限公司，山西 長治 046000；2.國家生物醫(yī)學分析中心，北京 100850；3.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100071

雪蓮屬菊科鳳毛菊屬草本植物，主要分布于我國青藏高原及其毗鄰地區(qū)，屬于藏藥中的名貴藥材，八世紀藏族古代藥物文獻《月王藥診》中記載其具有散寒除濕、活血通絡(luò)、抗癌、抗炎及抗疲勞等功效，可治療婦女月經(jīng)不調(diào)、風濕性關(guān)節(jié)炎、癰瘡腫毒和高山不適應(yīng)等多種疾病[1]。然而，由于野生雪蓮獨特的生長環(huán)境，人工栽培困難，加之近年采挖過度，導致該物種瀕臨滅絕。為解決珍稀瀕危藥用植物的資源問題，軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所胡顯文課題組經(jīng)過多年探索，獲得了穩(wěn)定高產(chǎn)黃酮的水母雪蓮細胞系，并建立了大規(guī)模植物細胞培養(yǎng)方法[2-3]，目前該項目已成功進行工業(yè)化生產(chǎn)。我們采用高效液相色譜（HPLC）研究了10 個批次的雪蓮培養(yǎng)物的指紋圖譜，并利用相對保留值和相對面積研究雪蓮培養(yǎng)物樣品之間的異同，為雪蓮培養(yǎng)物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

11 批雪蓮培養(yǎng)物均由山西康寶生物制品股份有限公司提供；刺五加苷B（紫丁香苷）對照品（國家標準物質(zhì)信息中心，批號：20110824）；綠原酸對照品（國家標準物質(zhì)信息中心，批號：20120314）；乙腈、三氟乙酸（色譜純，美國Fisher 公司）；其余試劑均為分析純。

HP1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），包括HP Degasser（在線脫氣機）、HP QUAT PUMP（四元梯度泵）、HP ALS（自動進樣器）、HP COLCOMP（柱溫箱）、HP DAD（二極管陣列檢測器）。

1.2 色譜條件

色譜柱為CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A 為0.1% TFA/水，流動相B 為0.1% TFA/乙腈，梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫40℃，進樣量20 μL。理論塔板數(shù)以紫丁香苷峰計，應(yīng)不低于2500。紫丁香苷、綠原酸色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。洗脫條件：0～1 min，0～0B%；1～16 min，0～10B%；16～41 min，10～25B%；41～56 min，25～60B%；56～65 min，60～100B%。

1.3 對照品溶液的制備

分別取紫丁香苷、綠原酸對照品適量，精密稱定，加水溶解并稀釋至20 μg/mL 的對照溶液，搖勻，備用。

1.4 供試品溶液的制備

取本品0.2 g，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加水約8 mL 超聲波處理30 min，降至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，備用。

1.5 測定法及數(shù)據(jù)處理

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄60 min 的色譜圖。數(shù)據(jù)處理采用中國藥典委員會推薦的“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件”（版本2004A），將10個批次的色譜圖進行比較，得到可全面反映多個色譜圖特征的雪蓮培養(yǎng)物的對照指紋圖譜，計算每個色譜圖與之相比較的相似度。

2 結(jié)果

2.1 供試品提取條件

2.1.1 提取溶劑 稱取雪蓮培養(yǎng)物（批號20111121）樣品5 份，每份0.2 g，分別置于10 mL 玻璃離心管中，分別加入100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、水各8 mL，超聲波提取20 min 后濾過，取濾液置于10 mL容量瓶中，加入各溶劑至刻度，分別取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)液相色譜圖顯示，水作為提取溶劑的色譜峰比例適中，信息豐富，所以選擇純水作為提取溶劑。

2.1.2 提取方式 稱取雪蓮培養(yǎng)物（批號20111121）樣品3 份，每份0.2 g，分別置于10 mL 玻璃離心管中，加入水8 mL，分別采用室溫浸提24 h、加熱回流1 h、超聲提取30 min等3種方式提取后，濾過，取濾液置于10 mL容量瓶中，加入水至刻度，分別取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。比較各色譜圖，結(jié)果顯示超聲波提取效果最好，方法簡單，重現(xiàn)性好，色譜峰較多。

2.1.3 提取時間 稱取雪蓮培養(yǎng)物（批號20111121）樣品2 份，每份0.2 g，分別置于10 mL 玻璃離心管中，分別加入水8 mL，分別采用超聲波提取30 和60 min 后，濾過，取濾液置于10 mL 容量瓶中，加入水至刻度，分別取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。比較各色譜圖，結(jié)果顯示提取30 min 和60 min 的色譜峰數(shù)量和強度差別不明顯，所以選擇提取時間為30 min。

2.2 色譜條件

2.2.1 檢測波長 參照文獻[5]，比較了檢測波長分別為220、260、280、320、360 nm 時的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)提取液在220 nm波長有較好的色譜信息，但基線噪音較高，不利于分析。提取液在260 nm波長下各色譜峰均有較好的紫外吸收，色譜信息豐富、適中，特征峰之間分離良好，因此選擇260 nm作為檢測波長。

2.2.2 流動相 分別采用0.1%甲酸/水-0.1%甲酸/乙腈、0.1%乙酸/水-0.1%乙酸/乙腈、0.1%磷酸/水-0.1%磷酸/乙腈、0.1% TFA/水-0.1% TFA/乙腈等流動相進行梯度洗脫，記錄色譜圖。根據(jù)圖譜對比，發(fā)現(xiàn)以0.1% TFA/水-0.1% TFA/乙腈為流動相時，在線性梯度下各組分得到較好的分離。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一批雪蓮培養(yǎng)物樣品（批號20111121）制備供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，以紫丁香苷的保留時間和峰面積為對照，計算各共有峰的相對保留時間和峰面積，結(jié)果相對保留時間相對標準偏差（RSD）均小于3%，占總峰面積百分比5%以上的共有峰的相對峰面積RSD均小于3%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 稱取同一批雪蓮培養(yǎng)物樣品（批號20111121）5 份制備供試品溶液，分別進樣測定。以紫丁香苷的保留時間和峰面積為對照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果相對保留時間RSD均小于3%，占總峰面積百分比5%以上的共有峰的相對峰面積RSD均小于3%，表明本方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批雪蓮培養(yǎng)物樣品（批號20111121）制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、10 h 進樣測定。以紫丁香苷的保留時間和峰面積為對照，計算各共有峰的相對保留時間和峰面積比值，結(jié)果相對保留時間RSD均小于3%，占總峰面積百分比5%以上的共有峰的峰面積比值RSD均小于5%，結(jié)果表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 雪蓮培養(yǎng)物HPLC指紋圖譜的建立

采用相對保留時間標定共有指紋峰，記錄60 min 的色譜圖，以圖譜中紫丁香苷為參照物，各指紋峰保留時間與同一圖譜中參照物峰的保留時間的比值為各指紋峰的相對保留時間，計算10 批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜中各指紋峰的相對保留時間，以此確定共有指紋峰，各共有指紋峰的平均相對保留時間見表1，共標定出雪蓮培養(yǎng)物的共有指紋峰9個。具有代表性的圖譜見圖1。采集對照品紫丁香苷和綠原酸的UV 光譜圖及水母雪蓮培養(yǎng)物7 號和8 號峰的UV 光譜圖進行比較，確定其中7 號峰為紫丁香苷，8號峰為綠原酸（圖2）。分別統(tǒng)計10批各共有峰面積與基準峰面積的比值，結(jié)果各共有峰的面積比值相對固定，單峰面積占總峰面積大于或等于10%，而小于20%的共有峰有4 個，分別為1、4、5、9 號，其差值小于±25%；單峰面積占總峰面積≥20%的共有峰有1個，為7 號峰，即紫丁香苷色譜峰。單峰面積占總峰面積＜10%的共有峰，不作要求。10批共有指紋峰面積的比值均符合中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）[4]。10 批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜共有峰的峰面積比值結(jié)果見表2。

圖1 雪蓮培養(yǎng)物和對照品的HPLC圖

2.5 樣品相似度評價

按照建立的HPLC 方法，分別測定了10 批雪蓮培養(yǎng)物的指紋圖譜，利用“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件”（版本2004A）對10 批樣品圖譜進行處理（圖3），并進行共有譜峰擬合和相似度評價，以夾角余弦法（全圖譜）計算的相似度評價結(jié)果為判斷標準，10 批樣品的相似度均大于0.9，相似度良好。表明樣品的化學組成和含量基本一致，質(zhì)量穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

3 討論

色譜指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制方法，可對中藥產(chǎn)品的真實性、質(zhì)量的一致性及穩(wěn)定性進行有效檢測和控制[6]，也可作為植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)珍稀瀕危野生中藥材的有效質(zhì)量控制方法。

圖2 雪蓮培養(yǎng)物和對照品的UV圖

圖3 10批雪蓮培養(yǎng)物樣品指紋圖譜

表1 10批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表2 10批雪蓮培養(yǎng)物指紋圖譜共有峰的峰面積比值

表3 10批雪蓮培養(yǎng)物相似度評價結(jié)果

我們采用HPLC 法對雪蓮培養(yǎng)物的特征成分進行了分析，考察了儀器的精密度，方法的重復性、精密度和樣品的穩(wěn)定性，同時對10 批雪蓮培養(yǎng)物進行了指紋圖譜檢測。結(jié)果表明，本研究建立的雪蓮培養(yǎng)物HPLC 指紋圖譜檢測方法穩(wěn)定、可靠、專屬性強、重現(xiàn)性好，采用相似度評價軟件對指紋圖譜結(jié)果進行評價，操作簡便，不需大量復雜的計算，且數(shù)據(jù)的采集和處理更為全面和客觀，可用于雪蓮培養(yǎng)物產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

[1]楊永昌.藏藥志[M].西寧:青海人民出版社,1992.

[2]胡顯文,高麗華,趙德修,等.用于大規(guī)模植物細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定高產(chǎn)黃酮的雪蓮細胞系及其建立方法[P].中國專利,CN1424395,2003-06-18.

[3]胡顯文,高麗華,李佐虎,等.穩(wěn)定高產(chǎn)黃酮的雪蓮細胞系TUIP-8 的大規(guī)模高密度培養(yǎng)方法[P].中國專利,CN1556199,2004-12-22.

[4]國家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）[S].北京:國家藥品監(jiān)督管理局,2000.

[5]苗愛東,孫殿甲,彭燕,等.HPLC 法建立新疆雪蓮指紋圖譜研究[J].中成藥,2003,(9):3-5.

[6]謝培山.色譜指紋圖譜分析是中草藥質(zhì)量控制的可行策略[J].中藥新藥與臨床藥理,2001,(5):141-151.