H-Ras結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)及純化

馮瀅瀅 ，張?jiān)旗o，徐小潔，李玲，郭靖，洪甜，張蓉，趙克，葉棋濃

1.第二炮兵總醫(yī)院 肛腸科，北京 100088；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

H-Ras 基因首先從人膀胱癌細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)，由Der等[1]分離得到。它位于人類第11號染色體，與K-Ras、N-Ras 共同組成Ras 家族。Ras 蛋白屬于小G 蛋白，通過參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而調(diào)控細(xì)胞分化與增殖[2]。Ras 癌基因與人類腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。H-Ras癌基因正常時(shí)可調(diào)控細(xì)胞生長路徑，發(fā)生異常時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長以至癌變[3]。因此，探討Ras 基因?qū)ρ芯坎糠帜[瘤的發(fā)生與發(fā)展具有重要意義。

Ras 基因編碼相對分子質(zhì)量約21×103的蛋白，又稱p21 蛋白或Ras 蛋白[4]。H-Ras、K-Ras、N-Ras的氨基酸序列有85%的同源性，N端1～165位氨基酸殘基高度保守，165～189/188位氨基酸殘基存在高度差異，從而導(dǎo)致其功能的差異[5]。研究發(fā)現(xiàn)，K-Ras、N-Ras、H-Ras 在不同腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)不同，其功能也不盡相同。基于此認(rèn)識，我們擬將H-Ras 基因片段化，分別構(gòu)建H-Ras（1-165）和H-Ras（165-189）的原核表達(dá)載體，為下一步深入研究H-Ras 基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、Rossate，原核表達(dá)載體pGEXKG，質(zhì)粒Myc-H-Ras由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所保存；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4DNA 連接酶購自TaKaRa 公司；GST-Sepharose 4B購自Pharmacia 公司；引物由北京賽百盛生物技術(shù)公司合成；測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 人H-Ras（1-165）和H-Ras（165-189）編碼區(qū)基因的擴(kuò)增

以人Myc-H-Ras 質(zhì)粒為模板，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人H-Ras（1-165）序列合成上游引物（5'-CGGGAT CCATGACGGAATATAAGCTGGTGGTG-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGTCACTGCCGGATCTCACGC ACCAAC-3'），按以下條件擴(kuò)增H-Ras（1-165）編碼區(qū)：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延長7 min。

以人Myc-H-Ras 質(zhì)粒為模板，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人H-Ras（165-189）序列合成上游引物（5'-CGGGA TCCCACAAGCTGCGGAAGCTGAAC-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGTCAGGAGAGCACACACTTGCAG C-3'），按以下條件擴(kuò)增H-Ras（165-189）編碼區(qū)：95℃5 min；95℃30 s，58℃60 s，72℃20 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延長7 min。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pGEX-KG 載體，經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR 片段回收后再用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，形成帶有黏端的雙鏈，用T4DNA 連接酶連接入pGEXKG 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，培養(yǎng)并提質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.4 融合蛋白GST-H-Ras（1-165）、GST-H-Ras（165-189）在大腸桿菌中的小量誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate 感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落，37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6～1.0，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，進(jìn)行Western印跡檢測。

1.5 融合蛋白GST-H-Ras（1-165）、GST-N-Ras（165-189）的純化與洗脫

將含pGEX-KG-H-Ras（1-165）、pGEX-KG-HRas（165-189）和pGEX-KG 的大腸桿菌Rossate 分別接種于含氨芐西林的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜活化，按10%的比例轉(zhuǎn)種于同種液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.4～0.6，加入IPTG 至終濃度為0.1 mmol/L，20℃繼續(xù)培養(yǎng)16 h，離心收集菌體，按Pharmacia 公司提供的方法進(jìn)行GST 融合蛋白的純化：加入裂解液，超聲波破碎，收集上清，加入適量GST-Sepharose 4B 結(jié)合4 h，離心收集GST-Sepharose 4B 小顆粒，充分洗脫未結(jié)合蛋白質(zhì)，用還原性谷胱甘肽小量多次地將GST-H-Ras（1-165）、GST-H-Ras（165-189）從珠子上逐漸洗脫，最后以SDS-PAGE鑒定純化與洗脫的蛋白。

2 結(jié)果

2.1 人H-Ras（1-165）和（165-189）編碼區(qū)基因的克隆

以Myc-H-Ras 質(zhì)粒為模板擴(kuò)增H-Ras（1-165）和H-Ras（165-189）的編碼區(qū)，獲得大小分別約為500和100 bp的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期一致（圖1）。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將2 種PCR 產(chǎn)物用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后分別與經(jīng)相同雙酶切的pGEX-KG載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，凝膠電泳可分別見約500 和100 bp 的條帶（圖2），表明H-Ras（1-165）、H-Ras（165-189）基因的編碼序列已分別插入pGEX-KG 上游的多克隆位點(diǎn)中。DNA 序列測定結(jié)果顯示與已知序列完全一致，無突變發(fā)生（數(shù)據(jù)略）。

2.3 融合蛋白GST-H-Ras（1-165）、GST-H-Ras（165-189）的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過小量誘導(dǎo)后收集菌體，Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)GST-H-Ras（1-165）、GST-H-Ras（165-189）融合蛋白獲得正確表達(dá)（圖3）。

2.4 融合蛋白GST-H-Ras（1-165）、GST-H-Ras（165-189）的純化與洗脫

圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增

融合蛋白經(jīng)GST-Sepharose 4B 親和珠純化、還原性谷胱甘肽小量多次洗脫、考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果顯示獲得一定量的純度較高的GST-H-Ras（1-165）和GST-H-Ras（165-189）蛋白（圖4）。

3 討論

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖3 融合蛋白的Western印跡

圖4 融合蛋白純化并洗脫后的SDS-PAGE分析

自1982 年Weinberg 等發(fā)現(xiàn)人的膀胱癌細(xì)胞中有活化的H-Ras 基因后，Ras 基因家族H-Ras、KRas 和N-Ras 相繼被發(fā)現(xiàn)，分別定位于11、12 和1 號染色體上。Ras 基因的編碼產(chǎn)物是具有GTP 結(jié)合作用和GTP酶活性的G蛋白，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，能夠傳遞生長信號，結(jié)合GTP 時(shí)為活化狀態(tài)，而結(jié)合GDP時(shí)為失活狀態(tài)，正常狀態(tài)下Ras蛋白與GDP 結(jié)合，參與Ras/RAF/MEK/ERK/MAPK 途徑的信號傳導(dǎo)[6]。Ras基因最常見的激活方式為點(diǎn)突變，約30%的人類惡性腫瘤存在Ras 基因的點(diǎn)突變，常見的突變位點(diǎn)是12、13、61位密碼子，其中又以第12位密碼子突變最為常見[7]。不同類型腫瘤中存在不同的Ras 基因突變。膀胱癌和甲狀腺癌常見H-Ras基因突變。一旦Ras 基因激活，導(dǎo)致其GTPase 活性下降或Ras 蛋白構(gòu)型改變從而與GTP 結(jié)合后，不需外界生長信號的刺激，便保持持續(xù)活化狀態(tài)，激活下游MAPK 級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞大量增殖，凋亡減少，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。此外，正常的Ras 基因也可因過度表達(dá)而誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化[8]。最近的研究發(fā)現(xiàn)Ras 激活還能調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成，與細(xì)胞自噬、細(xì)胞能量代謝也存在一定的關(guān)系[9-10]。不僅如此，Ras 的突變還與腸癌患者表皮生長因子受體單克隆抗體（西妥昔單抗）的耐藥密切相關(guān)[11]。所以，構(gòu)建原核表達(dá)載體GST-H-Ras，有助于進(jìn)一步了解H-Ras在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

Ras蛋白家族具有高度特異性和同源性[12]，所有的Ras家族成員的基因編碼區(qū)都有5個(gè)外顯子，其中1個(gè)外顯子不編碼蛋白質(zhì)，因?yàn)榍?65位氨基酸殘基序列無種屬間差別且高度保守。Ras 家族3 個(gè)高度同源的亞型的不同生物學(xué)功能主要?dú)w于C 端高度變異區(qū)的不同序列，這后25位氨基酸殘基（166～188/9）是它們之間惟一不同的區(qū)域，也包含著Ras 與細(xì)胞膜內(nèi)信號聯(lián)系的必要蛋白序列[5]。

綜上，我們以人Myc-H-Ras 質(zhì)粒為模板擴(kuò)增了H-Ras（1-165）和H-Ras（166-189）編碼序列，首次將H-Ras 基因片段化，構(gòu)建出上述2 個(gè)片段的原核表達(dá)載體，并表達(dá)、純化得到純度較高的重組蛋白GST-H-Ras（1-165）和GST-H-Ras（165-189），為后續(xù)研究H-Ras 片段與其他癌/抑癌蛋白之間的相互作用，深入探討其致癌機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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