人自噬相關(guān)基因5真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定

紀(jì)貝貝 ，趙暉，徐小潔，梁迎春，黃蓉，范忠義，李玲，郭靖，洪甜，冀全博，葉棋濃，杜楠

1.解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院，北京 100048；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

自噬是指胞漿內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器在膜包囊泡中大量降解的生物學(xué)過程，具有維持細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，然而過度自噬則可引起細(xì)胞死亡，即“自噬性細(xì)胞死亡”，也稱為Ⅱ型程序化細(xì)胞死亡[1]。迄今，已有31 個自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，ATG）相繼被發(fā)現(xiàn)[2]，其中的自噬相關(guān)基因5（autophagy related gene 5，ATG5）是形成自噬體的重要基因[3]。自噬體的形成主要通過2 個泛素樣連接系統(tǒng)介導(dǎo)，即ATG12-ATG5 和ATG8-PE，同時它們之間也互相影響[4]，ATG5通過酶促級聯(lián)，這一過程需要E1（ATG7）E2（ATG10）酶催化形成ATG5 和ATG12 結(jié)合復(fù)合物，而這一復(fù)合物對自噬的形成具有重要調(diào)控作用[5]。

有研究表明，敲除ATG5 基因后可明顯抑制自噬的形成[6-7]，由此可見ATG5 在自噬的形成及發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本實驗擬構(gòu)建ATG5 的真核表達(dá)載體，并驗證其與Myc-ATG12 的相互作用，為進(jìn)一步探討ATG5與自噬的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T 細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng)；pcDNA3-Flag載體為本實驗室保存；VigoFect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、PCR 試劑均購自TaKaRa 公司；上、下游引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；質(zhì)粒提取、膠回收、PCR 回收試劑盒購自Promega 公司；HRP 標(biāo)記的抗Flag 標(biāo)簽鼠單克隆抗體（Flag-HRP）購自Sigma 公司；DMEM 及小牛血清均購自Gibco 公司；測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 Flag-ATG5重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測序

以人乳腺文庫為模板，根據(jù)文獻(xiàn)報道[8]的ATG5的編碼序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATGAC AGATGACAAAGATGTGC-3'）和下游引物（5'-CCG CTCGAGTCAATCTGTTGGCTGTGGGATG-3'），PCR擴(kuò)增人ATG5的編碼序列（95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72℃延長7 min），用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

將PCR 片段回收后用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用T4DNA連接酶與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3-Flag 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，振蕩培養(yǎng)并提質(zhì)粒，用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.3 哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測

按常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用不含雙抗、含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將人胚腎293T 細(xì)胞接種于6 cm 皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到80%為宜，培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h 換液。將4 μL VigoFect與200 μL NaCl混合，再將總量為10 μg 的重組質(zhì)粒與200 μL NaCl 混合，然后將上述2 種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中（以同樣方法轉(zhuǎn)染空pcDNA3-Flag 載體作為對照），37℃、50 mL/L CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h 換液，轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞蛋白，加入2×SDS 加樣緩沖液煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000 稀釋的用HRP 標(biāo)記的抗Flag 標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 細(xì)胞免疫共沉淀分析ATG5和ATG12的相互作用

將人胚腎293T 細(xì)胞接種于6 cm 皿中，用重組Flag-ATG5 與Myc-ATG12 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4～6 h換液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，加入IP裂解緩沖液［0.02 mol/L Tris（pH8.0），0.05 mol/L NaCl，0.005 mol/L NP-40，0.01 mol/L EDTA）］后與Flag-Beads在4℃結(jié)合4～6 h，3000 r/min離心5 min，經(jīng)IP緩沖液再次漂洗后，加入與Flag-Beads 等量的2×SDS 加樣緩沖液，煮沸10 min，12 000 r/min 離心2 min，取上清液行SDS-PAGE 后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000 稀釋的用HRP 標(biāo)記的抗Flag 標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光法顯色，5 min后壓片顯影。

2 結(jié)果

2.1 Flag-ATG5重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以實驗室保存的人乳腺文庫為模板，PCR 擴(kuò)增人ATG5 的編碼序列，獲得約820 bp 的DNA 片段，與預(yù)期片段一致（圖1A）；將PCR 產(chǎn)物用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3-Flag 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定得到陽性重組克?。粚⑺藐栃钥寺√豳|(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，可切出2 條長度分別約為5000 和820 bp的條帶，而相應(yīng)的空載體酶切只見大片段，符合預(yù)期結(jié)果（圖1B）；測序結(jié)果表明，插入片段的DNA 序列與人ATG5基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。

2.2 Western 印跡檢測Flag-ATG5 在293T 細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的Flag-ATG5重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞系，24 h 后提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，Western 印跡檢測Flag-ATG5 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，用Flag-HRP 抗體能夠在相對分子質(zhì)量約33×103處檢測到明顯的特異性條帶，空載體無條帶（圖2）。說明Flag-ATG5 重組蛋白在293T細(xì)胞中能夠正確表達(dá)。

2.3 免疫共沉淀分析重組ATG5與ATG12在蛋白水平上的相互作用

圖1 PCR擴(kuò)增人ATG5的編碼序列（A）及重組質(zhì)粒Flag-ATG5的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜（B）

根據(jù)文獻(xiàn)報道，ATG5 可與ATG12 相互作用。為進(jìn)一步證實所構(gòu)建的Flag-ATG5 重組質(zhì)粒正確，且能夠表達(dá)正確的融合蛋白，我們將重組Flag-ATG5 質(zhì)粒與Myc-ATG12 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，24 h 常規(guī)培養(yǎng)后收集蛋白，免疫共沉淀分析顯示Flag-ATG5 融合蛋白與Myc-ATG12 蛋白具有相互作用，而Flag 空載體在同一位置無此條帶，表明ATG5 與ATG12 蛋白能夠在體內(nèi)特異地相互作用，而Flag 標(biāo)簽不影響ATG5 的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能（圖3）。進(jìn)一步證明構(gòu)建的重組Flag-ATG5 質(zhì)粒正確，且能夠正常表達(dá)。

圖2 Western印跡檢測Flag-ATG5的表達(dá)

圖3 免疫共沉淀分析驗證重組ATG5與ATG12在蛋白水平上具有相互作用

3 討論

自噬是真核生物所特有的生命現(xiàn)象，是細(xì)胞通過溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)，并以此保持細(xì)胞代謝的平衡和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這一過程可以促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖，自噬的整個過程受自噬相關(guān)基因的調(diào)控[9]。細(xì)胞自噬既能在細(xì)胞應(yīng)對不良環(huán)境刺激時作為一種防御機(jī)制實現(xiàn)自我保護(hù)，同時在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、病原體感染、衰老等多種疾病的發(fā)生過程中起到重要作用[10]。近年來的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)自噬與腫瘤存在密切關(guān)聯(lián)，針對二者關(guān)系的研究已受到腫瘤學(xué)者的廣泛關(guān)注[11]。

細(xì)胞自噬大致分為3 個階段[12-13]：第一階段為起始階段（細(xì)胞接受刺激信號）；第二階段為自噬體形成（ATG12-ATG5 和ATG8-PE 復(fù)合體2 種泛素樣結(jié)合系統(tǒng)）；第三階段為自噬溶酶體的形成及內(nèi)容物的降解，而自噬體膜脫落再循環(huán)利用。由此可知，ATG5在自噬體的形成中占有重要地位，同時研究發(fā)現(xiàn)ATG5 作為細(xì)胞自噬和凋亡的轉(zhuǎn)換開關(guān)，在自噬的發(fā)生和發(fā)展中起重要的調(diào)控功能[14]，在自噬泡形成的早期階段有ATG12-ATG5-ATG16L復(fù)合物與其外膜結(jié)合[7,15]，這種結(jié)合促進(jìn)了自噬泡的伸展擴(kuò)張，使之由開始的小囊泡發(fā)展為半環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

Chen 等[16]發(fā)現(xiàn)，TECPR1 在ATG5-ATG12 復(fù)合體的形成中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而在很大程度上影響自噬體的形成。這也提示我們ATG5 在整個自噬過程中的重要作用。本實驗構(gòu)建的Flag-ATG5在真核細(xì)胞中獲得了表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白的功能得到初步驗證。ATG5在真核細(xì)胞中的成功表達(dá)，是繼續(xù)深入研究其在自噬中的作用機(jī)制，以及探討其利用價值的基礎(chǔ)。

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