北極海洋沉積物高抗氧化活性菌株的篩選及其多樣性分析＊

王 楨，李 陽，車 帥，林學(xué)政＊

（1.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061；2.國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室，山東 青島266061）

極地是地球生物圈中重要的組成部分之一，極地微生物能夠適應(yīng)各種強脅迫條件而快速生長和繁殖，是巨大的基因遺傳變異庫［1］，也為人們尋找新的微生物或篩選新的活性代謝產(chǎn)物提供了豐富的種質(zhì)資源［2］。特殊的極地環(huán)境造就了極地微生物特殊的生物學(xué)特征及競爭優(yōu)勢。棲息于極地的細菌，為了適應(yīng)惡劣的環(huán)境條件，必須采用獨特的生存策略來獲得生存優(yōu)勢［3］。極地由于臭氧空洞的存在，使UV－B輻射增強，可誘導(dǎo)生物細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生；酷寒的自然環(huán)境，使得海水中溶解氧含量升高［4］；除此之外，有研究證明，冷脅迫往往伴隨著細胞內(nèi)氧脅迫的增加而增加［5］。因此，極地微生物必然逐漸形成高水平的氧化應(yīng)激反應(yīng)來對活性氧產(chǎn)生較強的耐受性，以此適應(yīng)特殊的生存環(huán)境。

活性氧會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，以此破壞膜的流動性，使線粒體凋亡［6］；對特定的氨基酸序列進行修飾，裂解肽鏈?zhǔn)姑甘Щ?，對蛋白質(zhì)造成氧化損傷?；钚匝踹€可造成基因缺失、突變等影響［7］。生物體利用氧化應(yīng)激反應(yīng)來消除活性氧的損害［8］，而適當(dāng)補充外源性抗氧化劑可清除自由基，阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保持食物品質(zhì)、治療或緩解病癥。因此，發(fā)展和應(yīng)用更多有效的天然來源抗氧化劑正日益受到人們的關(guān)注。韓樂琳等［9］對南極地衣提取物的抗氧化能力進行了初步研究，結(jié)果表明南極地衣具有較高的抗氧化活性；閻雪芬等［10］對分離自北極海洋沉積物的81株真菌進行了抗氧化活性的篩選，其中7株對活性氧具有抑制作用；而其對93株紅樹林的內(nèi)生真菌也進行了抗氧化的篩選，僅有1株具有抑制活性氧的作用，以上結(jié)果表明，海洋真菌是產(chǎn)生抗氧化活性物質(zhì)的重要來源。Pereira等［11］對從南極發(fā)草、南極漆姑草和檜葉金發(fā)蘚的提取物進行了抗氧化活性的研究，發(fā)現(xiàn)其能明顯減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，具有明顯的抗氧化特性。而對微生物特別是北極細菌抗氧化活性的研究報道較少［12－13］。

本文對分離自中國第五次北極科考采取的海洋沉積物的細菌進行了具抗氧化性活性菌株的篩選，并進一步測定了其對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除能力；利用16SrRNA基因?qū)ζ溥M行了分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析，以期為了解極地微生物的抗氧脅迫機制及極地來源的新型生物活性物質(zhì)的研發(fā)打下一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

北極海域海洋沉積物樣品為2012－07－09中國第五次北極科學(xué)考察采集，對箱式采樣器和重力采樣器采到的海洋沉積物樣品，用無菌藥匙采集后置于無菌封口袋中，于雪龍船現(xiàn)場進行可培養(yǎng)細菌的分離純化并于4℃保存，回實驗室后進行進一步的分離純化培養(yǎng)與鑒定。

海水Zobell 2216E培養(yǎng)基（1 000mL）：蛋白胨5g，酵母粉1g，瓊脂粉15g，V（過濾原位海水）∶V（自來水）＝1∶2。

1.2 具有H2O2耐受性的活性菌株的篩選

向Zobell 2216E液體培養(yǎng)基中添加適量H2O2使其終濃度為1.0mmol／L后作為實驗組，對照組則加入等量蒸餾水；按體積分數(shù)1%的接種量接入過夜活化的菌株，于10℃，150r／min振蕩培養(yǎng)24h后利用分光光度計于600nm下測其培養(yǎng)液OD值［20］。以實驗組OD值／對照組OD值×100%＞60%為依據(jù)，篩選具有高H2O2耐受性的細菌。

1.3 活性菌株的抗氧化能力檢測

將篩選到的活性菌株活化后接種于Zobell 2216E液體培養(yǎng)基中，于10℃，150r／min振蕩培養(yǎng)24h，培養(yǎng)液經(jīng)6 000r／min，4℃離心10min后，收集菌體經(jīng)PBS緩沖液兩次洗滌后，再將菌體細胞重懸，調(diào)整細胞濃度為1.0×109個／mL，以此作為樣品溶液，待測其對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子的清除能力。

1.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

取樣品2mL，加入0.2mmol／L DPPH和無水乙醇1mL，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30min，并在6 000 r／min下離心10min，取上清液于517nm測定其吸光度，與待測液相同體積濃度為1mmol／L的抗壞血酸做陽性對照，空白組以等體積無水乙醇代替DPPH溶液，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液空白調(diào)零，于517nm分別測定其吸光度［14］。DPPH自由基的清除率為：

式中，A0為對照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

1.3.2 羥自由基（HO·）清除能力的測定

在具塞試管中依次加入1mL 5mmol／L硫酸亞鐵溶液，1mL 5mmol／L水楊酸－乙醇溶液，1mL 3mmol／L雙氧水溶液，混勻后加入0.5mL的待測樣品，用雙蒸水補齊至刻度10mL，在（37±0.1）℃的恒溫水中反應(yīng)15min后，6 000r／min離心10min，然后以雙蒸水作參比，在510nm下測定吸光度［15］。與待測液相同體積濃度為1mmol／L的抗壞血酸做陽性對照。清除率計算式為：

式中，A0為空白組的吸光度；Ax為加入待測溶液后的吸光度。

1.3.3 超氧自由基清除能力的測定

取4.5mL 0.1mol／L Tris－HCl緩沖液（pH＝8.2）于試管中，依次加入1.0mL 1.0mmol／L EDTA，1.0mL待測菌液，2.4mL蒸餾水。于25℃水浴反應(yīng)10min，再加入2.0mL 9mmol／L鄰苯三酚準(zhǔn)確反應(yīng)60min后，加入0.1mL 12.0mol／L HCl終止反應(yīng)，于325nm 處測定吸光度（As）［16］。與待測液相同體積濃度為1mmol／L的抗壞血酸做陽性對照。對照以1.0mL蒸餾水代替樣品，操作方法同樣品管，測得吸光度（Ac）。超氧自由基清除率：

式中，Ac為對照組的吸光度；As為樣品組的吸光度。

1.4 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

16SrRNA基因擴增中的DNA模板的制備和PCR引物參照文獻［17］進行。

反應(yīng)條件：95℃，5min；95℃，1min，55℃，30s，72℃，1.5min，30個循環(huán)；72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物股份有限公司進行純化和測序。測序獲得的16SrRNA基因序列在National Center for Biotechnology Information（NCBI）進行BLAST分析。序列比對采用BioEdit的多序列比對排列（Clustalw multiple alignment），系統(tǒng)發(fā)育分析采用 MEGA 4.0軟件的鄰接法（Neighbor－joining method）。利用EzTaxon－e Database檢索與活性菌株相似性最高的模式菌株，并與模式菌株的16SrRNA基因相似性進行比較（http：∥eztaxon－e.ezbiocloud.net）［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性菌株的篩選結(jié)果

根據(jù)H2O2耐受性實驗，對實驗室保存的145株北極海洋沉積物細菌進行了抗氧化活性菌株的篩選。以實驗組OD值／對照組OD值×100%＞60%作為菌株具有強抗氧化性的依據(jù)，共篩選出25株具有高H2 O2耐受性的菌株，有關(guān)實驗結(jié)果和采樣信息見表1。可見，篩選到的活性菌株的實驗組OD值／對照組OD值為62.63%～140.00%；值得指出的是，1mmol／L H2O2似乎對菌株563和720－2的生長具有一定的促進作用，其原因值得進一步研究。25株抗氧化活性菌株分離自12個站位中，水深從19～3 540m不等，由此可見，在北極海洋沉積物這一特殊生境中，廣泛分布著抗氧化細菌。

表1 H2O2耐受實驗結(jié)果及采樣信息Table 1 Results of hydrogen peroxide tolerance test and locations of samplings

續(xù)表

2.2 DPPH自由基、羥自由基（HO·）和超氧自由基清除能力的測定

由表2可見，25株活性菌株對DPPH自由基、羥自由基（HO·）和超氧自由基的清除能力：25株活性菌株對DPPH自由基有著不同的清除效率，清除率為25.36%～84.15%，其中以菌株563的清除率最高，可達84.15%；25株活性菌株對HO·也具有較強的清除能力，清除率在65.72%～88.61%之間；其中菌株567的清除能力最強，可達88.61%；通過鄰苯三酚自氧化法測定活性菌株的超氧自由基清除能力的研究結(jié)果也表明，25株菌株均對其有著一定的清除作用，但清除能力相對較弱，清除率為11.25%～45.77%，其中以菌株763－1超氧自由基的清除率最高，可達45.77%。

總體來說，菌株563對DPPH自由基、羥自由基（HO·）和超氧自由基清除能力都具有較好的清除作用，清除率分別為84.15%，70.71%，42.46%；菌株630對3種自由基也都具有較好的清除作用，清除率分別為83.89%，78.91%，45.56%。菌株563和630的抗氧化特性值得進一步研究。

表2 25株活性菌株對自由基清除能力的測定Table 2 Results of antioxidant activity of 25isolated antioxidative strains

2.3 活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

對25株抗氧化活性菌株的16SrRNA基因序列采用BioEdit軟件進行序列比對，然后利用MEGA 4.0軟件的鄰接法，構(gòu)建25株抗氧化菌株及其同源性較高的模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由圖1可見，篩選到的抗氧化活性菌株有著豐富的種類多樣性。從綱水平上來說，25株活性菌株分屬于細菌域的5個綱，其中有14株屬于γ－Proteobactria綱，占總菌株的56%，為優(yōu)勢種群；4株屬于α－Proteobacteria綱，占16%；4株屬于Actinobacteria＿c綱，占16%；有2株屬于Bacilli綱，占總菌數(shù)的8%；還有1株屬于Flavobacteria綱，占4%。從屬水平上來說，25株細菌分屬于15個屬，其中假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）多樣性最高，含4株菌，其次為鹽細菌屬（Salinibacterium），含有3株菌。種水平上，25株細菌分屬于20個種，多樣性豐富。

圖1 基于16SrRNA基因序列的具有抗氧化活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the bacteria with antioxidant activity based on the partial 16SrRNA gene sequences

3 討論

極地微生物不僅要適應(yīng)低溫，也需要抵御其他脅迫條件如紫外輻射等［19］。為了在極端環(huán)境中得以生存，這些微生物必然形成不同抗氧化系統(tǒng)去抵抗由活性氧引起的氧化脅迫。本文通過對來自北極深海沉積物中的145株菌株進行了抗氧化性菌株的篩選，獲得了25株抗氧化性較強的菌株；并采用DPPH自由基、羥自由基和超氧自由基清除能力實驗綜合評價了其抗氧化能力。三組實驗從多個角度對菌株抗氧化性能進行了測試，結(jié)果表明，對H2O2具有較強耐受性的活性菌株，對DPPH自由基、羥自由基和超氧自由基均有著一定的清除能力，但對三者的清除能力沒有必然聯(lián)系，不存在線性關(guān)系。

目前，對抗氧化菌株的篩選及其生物活性物質(zhì)的研究主要集中于乳酸桿菌，如張鳳敏等［20］從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選出兩株對過氧化氫耐受能力較強的乳酸菌，并研究了其對DPPH自由基和羥自由基的清除能力，表明這兩株乳酸菌對DPPH自由基和羥自由基都具有一定的清除能力。海洋抗氧化菌株的研究主要集中于真菌，如陳霞等［21］對8株來源于東海海洋的真菌提取物進行了抗氧化和抗腫瘤活性篩選，表明海洋真菌是潛在的活性代謝產(chǎn)物的重要來源。在極地微生物方面，則多集中于色素的抗氧化研究，如Daniela等［22］對從南極土地桿菌屬細菌Pedobactersp.中提取的混合色素進行抗氧化能力的檢測，表明這些色素具有極強的抗氧化能力。本文樣品取自具有強烈促氧化作用的北極生態(tài)系統(tǒng)，篩選到的抗氧化活性菌株的DPPH自由基清除率的范圍為25.36%～84.15%，羥自由基（HO·）清除率在65.72%～88.61%；而張鳳敏等［20］對篩選出的兩株高抗氧化活性乳酸菌對DPPH自由基和羥自由基（HO·）清除率最高僅分別為37.18%和10%。由此可見，本實驗獲得的活性菌株清除DPPH自由基和清除羥自由基能力更強。

研究結(jié)果表明，在極地海洋沉積物這一特殊的生境，廣泛分布著抗氧化活性菌株，且其種類多樣。從145株北極海洋沉積物微生物中分離到25株抗氧化活性菌株，比例可達17.2%；對25株活性菌株的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育表明，γ－Proteobacteria綱細菌數(shù)量最多，含14株，占總分離菌數(shù)的56%，物種多樣性也最為豐富，含有12個種，占所有種的60%；其次有4株屬于α－Proteobacteria綱，數(shù)量占總分離菌數(shù)的16%，分屬于3個種，占所有種比例達到15%；Actinobacteria＿c綱篩選得到4株，放線菌與人類關(guān)系密切，目前廣泛應(yīng)用的抗生素約70%是各種放線菌所產(chǎn)生。一些特殊的放線菌還能產(chǎn)生各種酶制劑、維生素和有機酸等。因此對北極地區(qū)放線菌次級代謝產(chǎn)物的研究具有重大的理論意義和應(yīng)用價值。

極地特殊的環(huán)境條件造就了極地微生物特殊的生物學(xué)特征及競爭優(yōu)勢，棲息于極地的細菌，為了適應(yīng)惡劣的環(huán)境條件，必須采用獨特的生存策略來獲得生存優(yōu)勢［23］，這使其將成為研究低溫生物學(xué)的良好試驗材料及新型活性物質(zhì)的重要的潛在來源。有關(guān)極地微生物的資源勘探與代謝活性產(chǎn)物研發(fā)，已成為國際微生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一［24－25］。本文表明，北極蘊含著強抗氧化的細菌種質(zhì)資源，并具有極好的多樣性和豐富性。本文所獲結(jié)果有助于人們認識和開發(fā)北極這一特殊海域的抗氧化微生物資源，加速海洋微生物抗氧化活性物質(zhì)的開發(fā)利用。

致謝：中國第五次北極考察隊采集樣品及數(shù)據(jù)。

（References）：

［1］BOWLER C，KARL D M，COLWELL R R.Microbial oceanography in a sea of opportunity［J］.Nature，2009，459（7244）：180－184.

［2］RUSSO R，GIORDANO D，RICCIO A，et a1.Cold－adapted bacteria and the globin case study in the Antarctic bacteriumPseudoalteromonashaloplanktisTAC125［J］.Marine Genomics，2010，3（3－4）：125－131.

［3］GIUDICE A L，BRUNI V，MICHAUD L.Characterization of Antarctic psychrotrophic bacteria with antibacterial activities against terrestrial microorganisms［J］.Journal of Basic Microbiol，2007，47（6）：496－505.

［4］HERMES L M，ZENTENO S T.Animal responses to drastic changes in oxygen availability and physiological oxygen stress［J］.Comparative Biochemistry and Physiology，2002，1334（4）：537－556.

［5］GOCHEVA Y G，TOSI S，KRUMOVA E T，et al.Temperature downshift induces antioxidant response in fungi isolated from Antarctic［J］.Extremophiles，2009，13（2）：273－281.

［6］GREEN D R，REED J C.Mitochondria and apoptosis［J］.Science，1998，281（5381）：1309－1312.

［7］IMLAY J A.Pathways of oxidative damage［J］.Annual Review of Microbiology，2003，57：395－418.

［8］LOPEZ M G，ELNITSKY M A，BENOIT J B，et a1.High resistance to oxidative damage in the Antarctic midgeBelgicaantarcticaand developmentally linked expression of genes encoding superoxide dismutase，catalase and heat shock proteins［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2008，38（8）：796－804.

［9］HAN L L，WEI J C.A preliminary study on antioxidant ability of Antarctic lichen extract［J］.Institute of Microbiology，2009，28（6）：846－849.韓樂琳，魏江春.南極地衣提取物抗氧化能力的初步研究［J］.菌物學(xué)報，2009，28（6）：846－849.

［10］YAN X F，HUANG D H，DAI Y B，et a1.Study on antioxidant activity of marine fungi［J］.Journal of Xiamen University：Natural Science，2007，46（3）：418－421.閻雪芬，黃丹虹，代宇博，等.海洋真菌抗氧化活性物質(zhì)的初步研究［J］.廈門大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，46（3）：418－421.

［11］PEREIRA B K，ROSA R M，SILVA J D，et al.Protective effects of three extracts from Antarctic plants against ultraviolet radiation in several biological models［J］.Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2009，96：117－129.

［12］YAN X，NAGATA T，F(xiàn)AN X.Antioxidative activities in some common seaweeds［J］.Plant Foods for Human Nutrition，1998，52（3）：253－262.

［13］RUPEREZ P，AHRAZEM O，LEAL J A.Potential antioxidant capacity of sulfated polysaccharides from the edible marine brown seaweed fucus vesiculosus［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（4）：840－845.

［14］HUANG S S，LIU J，ZHAO Z.Study on antioxidative activity of two lactic acid bacteria［J］.China Dairy Industry，2010，38（10）：8－27.黃珊珊，劉晶，趙征.植物乳桿菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種菌體外抗氧化活性的對比研究［J］.中國乳品工業(yè)，2010，38（10）：8－27.

［15］LI Z Y，ZHANG H R，LIANG H Y.Comparison of the elimination of hydroxyl free－radicals by five kinds of wines［J］.Liquor－Making Science ＆Technology，2006，4：26－28.李志英，張海榮，梁會艷.5種葡萄酒清除羥自由基的比較［J］.釀酒科技，2006，4：26－28.

［16］LIU T W，PAN D D.Screening of lactic acid bacteria with antioxidant acitivity［J］.Food Science，2011，32（19）：125－129.劉天祎，潘道東.抗氧化活性乳酸菌的篩選［J］.食品科學(xué)，2011，32（19）：125－129.

［17］SUN F Q，WANG B J，LI G Y，et al.Diversity of bacteria isolated from the South China Sea sediments［J］.Acta Microbiologica Sinica，2008，48（12）：1578－1587.孫風(fēng)芹，汪保江，李光玉，等.南海南沙海域沉積物中可培養(yǎng)微生物及其多樣性分析［J］.微生物學(xué)報，2008，48（12）：1578－1587.

［18］KIM O S，CHO Y J，LEE K，et al.Introducing EzTaxon－e：aprokaryotic 16SrRNA Gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2012，62：716－721.

［19］SMITH R C，PREZELIN B B，BAKER B S，et al.Ozone depletion：ultraviolet radiation and phytoplankton biology in antarctic waters［J］.Science，1992，255（5047）：952－959.

［20］ZHANG F M，TIAN F M，CHEN W，et al.Screening of antioxidative lactic acid bacteria［J］.China Dairy Industry，2007，35（2）：4－7.張鳳敏，田豐偉，陳衛(wèi)，等.具抗氧化活性乳酸菌的篩選［J］.中國乳品工業(yè)，2007，35（2）：4－7.

［21］CHEN X，YI Y，ZHAO M R.Screening of antioxidative and antitumor activities of eight marine fungi［J］.Chinese Journal of Marine Drugs，2012，31（2）：1－6.陳霞，易喻，趙美蓉.8株海洋真菌的抗氧化和抗腫瘤活性篩選［J］.中國海洋藥物雜志，2012，31（2）：1－6.

［22］DANIELA N，CORREA L，MAXIMILIANO J，et al.Antioxidant capacity of novel pigments from an Antarctic bacterium［J］.The Journal of Microbiology，2012，50（3）：374－379.

［23］GIUDICE A L，VIVIA B，MICHAUD L.Characterization of Antarctic psychrotrophic bacteria with a ntibacterial activities against terrestrial microorganisms［J］.Journal of Basic Microbiology，2007，47（6）：496－505.

［24］MARX J C，COLLINS T，D＇AMICO S，et al.Cold－adapted enzymes from marine Antarctic microorganisms［J］.Marine Biotechnology，2007，9（3）：293－304.

［25］VARDHAN REDDY P V，SHIVA NAGESWARA RAO S S，PRATIBHA M S，et al.Bacterial diversity and bioprospecting for coldactive enzymes from culturable bacteria associated with sediment from a melt water stream of Midtre Loenbreen glacier，an Arctic glacier［J］.Research in Microbiology，2009，160（8）：538－546.