敲低膜聯(lián)蛋白A7對乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響*

田煥娜，吳雪艷，王小杰

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

敲低膜聯(lián)蛋白A7對乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響*

田煥娜，吳雪艷△，王小杰

（承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

目的：觀察靶向敲低人乳腺癌MCF-7細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A7（AXNA7）的表達(dá)對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響。方法：實驗分為3組，以靶向ANXA7的siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞為siRNA干擾組，另設(shè)陰性對照組、空白對照組，采用RT-PCR法和Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞ANXA7的表達(dá)情況，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測ANXA7低表達(dá)對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后，siRNA干擾組細(xì)胞ANXA7的表達(dá)明顯低于陰性對照組和空白對照組（P＜0.05）；敲低ANXA7后，MCF-7細(xì)胞凋亡明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論：ANXA7低表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡。

膜聯(lián)蛋白A7（AXNA7）；乳腺癌MCF-7細(xì)胞；凋亡

膜聯(lián)蛋白A7（Annexin A7，AXNA7）是膜聯(lián)蛋白家族成員，該家族具有典型的磷脂結(jié)合、Ca2+通道形成等特性［1］。有研究顯示，AXNA7參與細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，在膜轉(zhuǎn)運、細(xì)胞分化、凋亡、生長調(diào)節(jié)及鈣離子信號途徑等方面發(fā)揮廣泛的功能［2］。多種腫瘤組織ANXA7的表達(dá)發(fā)生了變化，提示ANXA7表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［3-4］。乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女生命健康的常見惡性腫瘤之一，有研究發(fā)現(xiàn)ANXA7與乳腺癌關(guān)系密切［3］。本研究擬采用RNA干擾技術(shù)敲低乳腺癌MCF-7細(xì)胞ANXA7的表達(dá)，觀察ANXA7低表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，以期為乳腺癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 MCF-7細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。β-actin鼠抗單克隆抗體，美國Santa Cruz公司；ANXA7鼠抗單克隆抗體、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、siRNA試劑、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、細(xì)胞總RNA提取試劑盒，美國? Invitrogen公司；蛋白定量試劑盒，上海生工生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌MCF-7細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM中，5% CO2、37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實驗分組 轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞種植于6孔板中，使細(xì)胞在24h內(nèi)達(dá)到40-60%的密度。按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按siRNA oligo 20pml/孔、脂質(zhì)體5?l/孔，分別將siRNA oligo和脂質(zhì)體加入無抗生素、無血清的DMEM培養(yǎng)液250?l中混勻，靜置5min；然后將兩液混合，室溫放置20min；將500?l脂質(zhì)體/siRNA混懸液逐滴加入培養(yǎng)板，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱；轉(zhuǎn)染后6h更換為含血清的培養(yǎng)基。其中轉(zhuǎn)染靶向ANXA7 siRNA的細(xì)胞為siRNA干擾組、轉(zhuǎn)染陰性siRNA的細(xì)胞為陰性對照組，空白對照組不做處理。

1.4 RT-PCR法檢測ANXA7 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，Trizol法提取細(xì)胞總RNA后，以其為模板使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。分別對目的基因和β-actin進(jìn)行PCR檢測。參照Genebank各基因序列的編碼區(qū)，所用引物：ANXA7上游引物 5' AAAGGTGCTGGCACAGATGAC 3'，下游引物為5' TGGCCCACAATAGCCAGAAG 3'，擴增的基因片段長度為176bp；β-actin上游引物5' TGGCACCCAGCA CAATGAA 3'，下游引物 5' CTAAGTCATAGTCCG CCTAGAAGCA 3'，擴增的基因片段長度為186bp。反應(yīng)體系20?l，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，2min；95℃30s；58℃ 30s；72℃延伸30s；共28個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后采用ZF型紫外透射反射分析儀攝片，應(yīng)用Quantity One V 4.52軟件進(jìn)行分析，以ANXA7條帶與內(nèi)參β-actin條帶的灰度比值作為ANXA7 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.5 Western blot法檢測ANXA7蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；一抗為ANXA7鼠抗人單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，ECL檢測。同時檢測相應(yīng)細(xì)胞β-actin的表達(dá)作為內(nèi)參照。應(yīng)用Quantity One V4.52軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值作為ANXA7蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，預(yù)冷的PBS輕輕洗滌3次，將細(xì)胞重懸于500?l預(yù)冷的結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml。取500?l細(xì)胞懸液于流式管中，加入5?l Annexin V混勻，室溫下避光孵育10min，上機前5min加入10mg/L碘化丙錠（PI）染液5?l。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況，重復(fù)3次。

2.1 siRNA沉默ANXA7的效果 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h，siRNA干擾組細(xì)胞ANXN7蛋白和mRNA的表達(dá)水平明顯低于陰性對照組和空白對照組（P＜0.05）。提示siRNA能有效降低MCF-7細(xì)胞ANXA7的表達(dá)水平（圖1-2，附表）。

2.2 ANXA7低表達(dá)對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，siRNA干擾組細(xì)胞的凋亡率明顯高于陰性對照組和空白對照組（P＜0.05），提示沉默ANXA7能夠促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡。見附表。?

圖1 MCF-7細(xì)胞ANXA7蛋白的表達(dá)

圖2 MCF-7細(xì)胞ANXA7mRNA的表達(dá)

附表 MCF-7細(xì)胞ANXA7的表達(dá)情況和凋亡情況（±s，n=3）

附表 MCF-7細(xì)胞ANXA7的表達(dá)情況和凋亡情況（±s，n=3）

與陰性對照組和空白對照組比較：*P＜0.05

組別 ANXA7 凋亡情況（%）蛋白 mRNA siRNA干擾組 0.58±0.09*0.49±0.07*4.54±0.09*陰性對照組 2.19±0.15 1.99±0.13 0.97±0.06空白對照組 2.34±0.17 2.11±0.12 0.99±0.07

3 討論

乳腺癌是全球范圍內(nèi)婦女最常見的惡性腫瘤之一，每年世界范圍內(nèi)女性乳腺癌的發(fā)病人數(shù)高達(dá)120萬以上，死亡人數(shù)達(dá)50萬以上。雖然歐美等西方國家是乳腺癌的高發(fā)區(qū)，但目前我國乳腺癌的發(fā)病率也逐年上升，并且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化的趨勢。乳腺癌常在淋巴結(jié)、骨髓、肺等組織形成轉(zhuǎn)移瘤，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)成為提高乳腺癌患者生存率的主要障礙。

AXNA7是膜聯(lián)蛋白家族最早發(fā)現(xiàn)的成員之一，在細(xì)胞中直接或間接與細(xì)胞漿和內(nèi)膜系統(tǒng)相聯(lián)系，與膜運輸、細(xì)胞增殖等有關(guān)［5］。關(guān)于AXNA7基因與腫瘤相關(guān)性的機制研究表明，AXNA7基因表達(dá)水平的改變可累及DNA修復(fù)基因、腫瘤抑制基因和與凋亡相關(guān)的基因［6］。但ANXA7在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用并無定論，在惡性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤和前列腺癌中，ANXA7可能是抑癌基因，然而在肝癌、胃癌、鼻咽癌、結(jié)直腸癌中，ANXA7可能是促癌基因［7］。因此，有必要進(jìn)一步研究AXNA7在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ANXA7低表達(dá)能促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞、肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡［8-9］。本研究進(jìn)一步觀察了siRNA干擾ANXA7表達(dá)后對乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，敲低ANXA7后，MCF-7細(xì)胞的凋亡明顯增加。本研究結(jié)果表明，ANXA7低表達(dá)能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡。但這種現(xiàn)象是通過何種作用途徑和信號通路實現(xiàn)的，ANXA7是否與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，均有待于深入研究。

［1］Creutz CE， Pazoles CJ， Pollard HB. Identif ication and purif ication of an adrenal medullary protein （synexin） that causes calciumdependent aggregation of isolated chromaff in granules［J］. J Biol Chem， 1978， 253（8）： 2858-2866.

［2］Jia L， Wang S， Cao J， et al. siRNA targeted against matrix metalloproteinase 11 inhibits the metastatic capability of murine hepatocarcinoma cell Hca-F to lymph nodes［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2007， 39（11）： 2049-2062.

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［5］宋麗萍，華子春，張欣，等.重組改良型人膜聯(lián)蛋白的核素標(biāo)記及體內(nèi)顯像的實驗研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（17）：2579-2581，2586.

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［7］Guo C， Liu S， Greenaway F， et al. Potential role of annexin A7 in cancers［J］. Clin Chim Acta， 2013， 423：83-89.

［8］李欣，陳雪，王小杰，等.膜聯(lián)蛋白A7低表達(dá)對人宮頸癌Hela細(xì)胞系增殖與凋亡的影響［J］.解剖學(xué)報，2010，41（4）：572-575.

［9］王小杰，梁秀軍，李欣.敲低膜聯(lián)蛋白A7對人肝癌HepG2細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響［J］.解剖學(xué)報，2014，45（6）：809-813.

EFFECTS OF AXNXA7 KNOCKDOWN ON APOPTOSIS OF BREAST CANCER MCF-7 CELLS

TIAN Huan-na， WU Xue-yan， WANG Xiao-jie
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate low expression of Annexin A7 （ANXA7） on apoptosis of breast cancer MCF-7 cells by target-silencing ANXA7 expression. Methods:MCF-7 cells were grouped into siRNA interference group， negative control group and blank control group. RNA interference technology was used to transfect the siRNA targeted ANXA7 into MCF-7 cells to knock down expression of ANXA7. Western blot and RT-PCR was used to detect the expression of ANXA7 after transfection； Flow cytometry was used to detect effects of low expression of ANXA7 on apoptosis of MCF-7 cells.Results: The expression of ANXA7 in MCF-7 cells of siRNA interference group were obviously lower than negative control group and blank control group （P＜0.05）. The apoptosis of MCF-7 cells increased after knocking down expression of ANXA7（P＜0.05）.Conclusions: Low expression of ANXA7 can promote apoptosis of breast cancer MCF-7 cells.

Annexin A7 （ANXA7）； Breast cancer MCF-7 cells； Apoptosis

R737.9

A

1004-6879（2015）03-0193-03

2014-12-04）