茜草等25種中藥材對(duì)5種植物病原真菌的抑制活性

牛贍光, 杜豐玉

(1. 山東省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)與生物藥物研究所, 濟(jì)南 250014;2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院, 青島 266109)

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茜草等25種中藥材對(duì)5種植物病原真菌的抑制活性

牛贍光1, 杜豐玉2*

(1. 山東省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)與生物藥物研究所, 濟(jì)南 250014;2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院, 青島 266109)

以蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌、棉花枯萎病菌、柑橘炭疽病菌與白菜黑斑病菌為供試菌，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定25種中藥材甲醇粗提物的抑菌活性。結(jié)果表明，在濃度為5.0 mg/mL時(shí)，大部分中藥材的甲醇粗提物對(duì)至少一種植物病原真菌都表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，其中知母、青蒿、細(xì)辛與白鮮皮對(duì)3種供試植物病原菌的抑制率大于75%，而茜草與姜黃對(duì)4種供試植物病原菌的抑制率均在80%以上，具有廣泛的抑菌譜。進(jìn)一步采用系統(tǒng)溶劑法得到的茜草不同溶劑萃取物中，水飽和正丁醇相抑菌活性明顯優(yōu)于石油醚及乙酸乙酯相，表明茜草抑菌活性成分主要為中等及大極性化合物。

中藥材; 茜草; 甲醇提取物; 植物病原真菌; 抑制活性

我國(guó)藥用植物資源十分豐富,僅中藥典籍《本草綱目》中收錄就超過(guò)1 000種,其中相當(dāng)一部分具有抑菌或殺蟲活性。因此,借鑒傳統(tǒng)藥用植物醫(yī)用研究成果,研究其對(duì)植物病害的防治作用,已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)植物源農(nóng)藥的重要途徑[1]。藥用植物是提取結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特的天然產(chǎn)物的重要資源,可從中發(fā)掘具有較好農(nóng)用抑菌活性的先導(dǎo)化合物,進(jìn)而開(kāi)發(fā)植物源農(nóng)藥[2]。近年來(lái),西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心從苦豆子[3]、大花金挖耳[4]、孜然[5]等藥用植物中,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了天名精內(nèi)酯酮和天名精內(nèi)酯醇[6]、枯茗醛和枯茗酸[7]等抑菌活性成分,有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為農(nóng)用殺菌劑。本論文選取了25種記載有醫(yī)用抑菌活性的中藥材,對(duì)其抑制植物病原真菌活性進(jìn)行了篩選,旨在為發(fā)掘抑菌活性先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試中藥材

25種中藥材購(gòu)自青島同方藥業(yè)有限公司,經(jīng)城陽(yáng)區(qū)人民醫(yī)院高瑞蓮醫(yī)師鑒定,分別隸屬于16科,見(jiàn)表1。中藥材粉碎,過(guò)20目篩,備用。

表1 供試中藥材種類

1.2 供試植物病原真菌

蘋果腐爛病菌(Valsamali)、蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriadothidea)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、柑橘炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)與白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)由山東省農(nóng)業(yè)仿生工程應(yīng)用技術(shù)研究中心提供,并經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院金靜教授鑒定。供試菌株接種在PDA斜面上,4 ℃冰箱保存。使用前,接種至PDA平板表面,25 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d備用。

1.3 中藥材甲醇粗提物與茜草不同溶劑萃取物的制備

分別稱取各中藥材粉末50 g,用300 mL甲醇浸泡1 h后,超聲波振蕩提取30 min,減壓抽濾,濾渣再采用上述方法處理,重復(fù)3次。合并濾液,減壓濃縮,冷凍干燥得到中藥材甲醇粗提物,密封后置于4 ℃冰箱保存。

對(duì)初篩具有較好抑菌活性的茜草甲醇粗提物,采用系統(tǒng)溶劑法制備不同極性溶劑的萃取物,進(jìn)一步考察其抑菌活性。將茜草的甲醇粗提物以一定量水混懸,依次用石油醚、乙酸乙酯及水飽和正丁醇進(jìn)行萃取,所得萃取液及剩余的水相經(jīng)濃縮干燥,得到茜草不同極性溶劑的萃取物,密封后置于4 ℃冰箱保存。

1.4 抑菌活性的離體測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定供試中藥材甲醇粗提物及茜草不同溶劑萃取物的抑菌活性。稱取適量甲醇粗提物,以50%乙醇混懸,加入到融化的無(wú)菌PDA培養(yǎng)基(約50 ℃)中混勻,得到濃度為5.0 mg/mL的含藥培養(yǎng)基平板。培養(yǎng)基中乙醇的含量小于3%,以含等量乙醇的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照,每處理3次重復(fù)。

稱取適量的茜草不同溶劑萃取物,以50%乙醇混懸,采用上述方法配制成1.0 mg/mL的含藥培養(yǎng)基平板。培養(yǎng)基中乙醇的含量小于3%,設(shè)置含等量乙醇的溶劑對(duì)照,每處理3次重復(fù)。

用打孔器打取生長(zhǎng)一致的植物病原真菌菌餅(6 mm),接種于含藥PDA平板以及對(duì)照PDA平板的中央(菌餅長(zhǎng)滿菌絲一面向下),25 ℃恒溫培養(yǎng),待對(duì)照平板長(zhǎng)滿菌絲時(shí),采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑,并按以下公式計(jì)算抑制率:

純生長(zhǎng)量(mm)=菌落平均直徑-菌餅直徑;

1.5 茜草與姜黃甲醇粗提物對(duì)植物病原真菌的毒力測(cè)定

以茜草與姜黃甲醇粗提物抑菌率較高的植物病原真菌為供試菌種,按照1.4所述方法,依次配制得到濃度為2.5、1.0、0.75、0.5與0.25 mg/mL的含藥培養(yǎng)基平板,以加入等量溶劑的平板為對(duì)照,每處理3次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0對(duì)藥劑濃度的對(duì)數(shù)(x)與校正抑制率的幾率值(y)進(jìn)行回歸分析,得到毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)及抑制中濃度(EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥材甲醇粗提物的抑菌活性

供試中藥材的甲醇粗提物濃度為5.0 mg/mL時(shí),25種中藥材甲醇粗提物中有14種分別對(duì)至少1種植物病原真菌的抑制率大于75%,占供試樣品的56%,分布于13個(gè)科;而知母、姜黃、青蒿、細(xì)辛、白鮮皮與茜草對(duì)至少3種供試植物病原菌的抑制率大于75%,具有廣泛的抑菌譜。其中,茜草甲醇粗提物對(duì)蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌與柑橘炭疽病菌的抑制率均大于90%,對(duì)棉花枯萎病菌也大于85%,值得進(jìn)一步深入研究;而姜黃甲醇粗提物對(duì)除蘋果輪紋病菌外的4種供試植物病原菌也表現(xiàn)出較好的抑制活性,抑制率均大于80%(表2)。

中藥材甲醇粗提物抑菌活性的選擇性明顯。近40%的中藥材甲醇粗提物分別對(duì)蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌與柑橘炭疽病菌有較好抑制活性,抑制率均大于75%;其中車前草甲醇粗提物對(duì)蘋果腐爛病菌與蘋果輪紋病菌的抑制率均大于95%,但對(duì)其余供試植物病原菌沒(méi)有抑制活性,具有明顯的選擇性。而對(duì)白菜黑斑病菌有較好抑制活性的僅有姜黃與五倍子甲醇粗提物,抑制率分別為80.6%與86.0%。此外,僅有姜黃、茜草與細(xì)辛甲醇粗提物對(duì)棉花枯萎病菌的抑制率大于75%,其余均小于60%。

表2 25種中藥材甲醇粗提物對(duì)5種植物病原真菌的抑菌活性1)

1) 表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。

The data are the means of three replicates.

2.2 茜草與姜黃甲醇粗提物的毒力測(cè)定

以茜草與姜黃甲醇粗提物抑制率較高的植物病原真菌為供試菌種,進(jìn)行毒力測(cè)定,結(jié)果(表3～4)表明,茜草與姜黃的甲醇粗提物對(duì)多種植物病原真菌有較好的抑制活性,尤其茜草甲醇粗提物對(duì)蘋果腐爛病菌、棉花枯萎病菌與柑橘炭疽病菌的EC50明顯低于姜黃,值得進(jìn)一步深入研究。

表3 茜草甲醇粗提物對(duì)部分植物病原真菌的毒力

表4 姜黃甲醇粗提物對(duì)部分植物病原真菌的毒力

續(xù)表4 Table 4(Continued)

植物病原真菌Plantpathogenicfungus濃度/mg·mL-1Concentration抑制率/%Inhibitionrate回歸方程(y=)Regressionequation相關(guān)系數(shù)(r)CorrelationcoefficientEC50/mg·mL-1白菜黑斑病菌Alternariabrassicae5.080.62.571.41.062.65.0577+1.2554x0.97090.900.7544.30.531.10.2524.8

2.3 茜草不同溶劑萃取物的抑菌活性

茜草不同極性溶劑的萃取物濃度為1.0 mg/mL時(shí),水飽和正丁醇萃取物的抑菌活性顯著優(yōu)于石油醚及乙酸乙酯萃取物,表明茜草抑菌活性成分主要為中等及大極性化合物(表5);而萃余物(水相)對(duì)蘋果腐爛病菌抑制率大于80%,可能與其中水溶性的鞣質(zhì)、有機(jī)酸與多糖有關(guān)。

表5 茜草不同溶劑萃取物對(duì)部分供試植物病原真菌的抑制活性1)

1) 表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。同列中不同英文字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

Data in the table are the means of three replicates. Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

3 小結(jié)與討論

本文對(duì)16科的25種中藥材甲醇粗提物進(jìn)行了離體抑菌活性篩選。結(jié)果表明,甲醇粗提物濃度為5.0 mg/mL時(shí),大部分中藥材對(duì)供試植物病原真菌都表現(xiàn)出不同程度的抑制活性;其中知母、姜黃、青蒿、細(xì)辛、白鮮皮與茜草甲醇粗提物對(duì)至少3種供試植物病原菌的抑制率大于75%,具有廣泛的抑菌活性。姜黃甲醇粗提物對(duì)除蘋果輪紋病菌外的4種供試植物病原菌都表現(xiàn)出較好的抑制活性,抑制率均大于80%。而茜草甲醇粗提物對(duì)蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌與柑橘炭疽病菌的抑制率均大于90%,其EC50分別為0.44、0.41與0.30 mg/mL。進(jìn)一步采用系統(tǒng)溶劑法得到的茜草不同溶劑萃取物中,水飽和正丁醇提取物對(duì)蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌、棉花枯萎病菌與柑橘炭疽病菌的抑制率均大于85%,顯著優(yōu)于其他溶劑萃取物,表明茜草抑菌活性成分主要為中等及大極性化合物。

據(jù)報(bào)道,知母乙醇粗提物濃度為30 mg/mL時(shí),對(duì)蘋果腐爛病菌與棉花立枯病菌的抑制率分別為72.4%與68.7%,遠(yuǎn)大于其丙酮粗提物的抑制活性[8];而本文中,知母甲醇粗提物在濃度為5 mg/mL時(shí),對(duì)蘋果腐爛病菌的抑制率達(dá)98.7%,表明知母不同極性溶劑萃取所得的粗提物成分存在差別。姜黃乙醇提取物在濃度為4 mg/mL時(shí),對(duì)玉米小斑病菌與小麥紋枯病菌具有較好的抑制活性,但對(duì)棉花枯萎病菌的抑制率僅為47.4%[9],這與本文中姜黃甲醇提取物的抑制率差別顯著,表明其不同溶劑提取物的抑菌活性選擇性明顯。茜草化學(xué)成分主要包括蒽醌、生物堿等中低極性及蒽醌糖苷、萘醌糖苷等大極性化合物,其活性研究一直集中在抑制細(xì)菌、消炎、鎮(zhèn)靜與抗腫瘤等醫(yī)用方面,其農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究較少[10-11]。楊敏麗等[12]從茜草的石油醚萃取物中分離得到萘醌類化合物——大葉茜草素,其對(duì)小菜蛾具有較好的觸殺活性;而本研究表明，茜草抗植物病原真菌活性成分存在于水飽和正丁醇萃取物中,主要為中等及大極性化合物。因此,綜合運(yùn)用柱層析與制備高效液相色譜法等多種分離手段,有望進(jìn)一步從茜草中分離到抑菌活性先導(dǎo)化合物,為中藥材的綜合利用及無(wú)公害生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Antifungal activities of the extracts from 25 traditional Chinese medicines against 5 plant pathogenic fungi

Niu Shanguang1, Du Fengyu2

(1. Institute of Forest Protection and Bio-druggery, Shandong Academy of Forestry Sciences, Ji’nan 250014, China; 2. College of Chemistry and Pharmacy, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

The antifungal activities of the extracts from 25 traditional Chinese medicines against 5 plant pathogenic fungi,Valsamali,Botryosphaeriadothidea,Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum,Colletotrichumgloeosporioides, andAlternariabrassicae, were studied using the growth rate method. The methanol extracts of most of 25 traditional Chinese medicines showed antifungal activities against at least one plant pathogenic fungi. The inhibition rates of extracts fromAnemarrhenaasphodeloides,Artemisiaannua,Asarumheterotropoidesvar.mandshuricum, andDictamnusdasycarpuswere more than 75% against 3 plant pathogenic fungi. The extracts fromRubiacordifoliaandCurcumalongaalso showed the significant inhibition rates of more than 80% against 4 plant pathogenic fungi at the concentration of 5 mg/mL. The methanol extract ofR.cordifoliawas further isolated to obtain four subfractions using different polar solvents. The bioactive screening exhibited that the subfraction of water-saturatedn-butanol showed a better antifungal activity than those of petroleum ether and ethyl acetate, which indicated that the bioactive compounds ofR.cordifoliashould have the medium and large polarities.

traditional Chinese medicine;Rubiacordifolia; methanol extract; plant pathogenic fungi; antifungal activity

2014-06-03

2014-07-30

山東省自然科學(xué)基金聯(lián)合專項(xiàng)(ZR2013CL023)；山東省林業(yè)科學(xué)研究院協(xié)作項(xiàng)目(601251)

S 482.292

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.020

* 通信作者 E-mail: fooddfy@126.com