新疆紫草石油醚提取物對(duì)小鼠生殖組織形態(tài)及其臟器指數(shù)的影響

戴 冰，曹璐婷，肖子曾*，吳沁璇，曾呈茜，楊夢(mèng)琳，張嘉倪

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208）

新疆紫草[Arnebia euchroma (Royle) Johnst]為2010 版《中華人民共和國(guó)藥典》收載的紫草品種之一。 味甘、咸，性寒，歸心、肝經(jīng)，具有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑等功效，是臨床常用的中藥[1]。 現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)新疆紫草具有良好的抗早孕、 抗生育作用，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，新疆紫草石油醚提取物是其抗生育作用的藥效部位[2]，但對(duì)其抗生育的毒性研究少有報(bào)道。 故通過(guò)開(kāi)展對(duì)新疆軟紫草石油醚提取物的蓄積毒性試驗(yàn)研究，對(duì)促進(jìn)新疆紫草作為抗生育新藥的研發(fā)，確保其在育齡婦女用藥安全得以逐步實(shí)現(xiàn)，豐富、發(fā)展中藥妊娠用藥禁忌理論提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 受試物

新疆紫草 （購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號(hào)1307220462；經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科檢驗(yàn)鑒定為新疆紫草。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，雌雄各半，健康適齡，體質(zhì)量18～22 g，共40 只，SPF 級(jí)，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004；飼養(yǎng)處及試驗(yàn)地：湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 主要儀器與試劑

RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠)；LEICA DM LB2 型雙目顯微鏡(德國(guó)LEICA 公司)；Shandon325 型石蠟切片機(jī)(英國(guó)Shandon 公司)；Motic B5 顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司)。

2 方法

2.1 新疆紫草石油醚提取物的制備[3]

稱(chēng)取3 kg 新疆紫草50 ℃干燥6 h 后粉碎。 將新疆紫草粉末平均分三份（每份1 kg）于滲漉筒中，加10 倍體積石油醚，浸泡12 h，以2 mL/min 的流速滲漉提取一個(gè)月，富集提取液，減壓回收溶劑。 濃縮液揮干溶劑后稱(chēng)重，計(jì)算每份固形物得率（相對(duì)于生藥材），分別為2.75%、2.68%、2.63%，平均固形物得率為2.69%。 動(dòng)物試驗(yàn)前以4%吐溫-80 助溶，50 ℃水浴加熱攪拌配制成混懸液備用。

2.2 蓄積毒性試驗(yàn)及蓄積系數(shù)計(jì)算

取昆明種小鼠40 只，雌雄各半，采用20 d 劑量遞增蓄積毒性試驗(yàn)法[4]，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組20 只。 以10 mL/kg 鼠重灌胃，對(duì)照組給以4%吐溫-80 水溶液，試驗(yàn)組小鼠給以配制的新疆紫草石油醚提取物混懸液， 以4 d 為一周期，初始給藥劑量為0.1 倍LD50（LD50按課題組急性毒性試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)3.48 g/kg 計(jì)算），1.5 倍遞增量每期遞增， 連續(xù)給藥到小鼠累積死亡一半時(shí)結(jié)束試驗(yàn)，共計(jì)17 d。計(jì)算累積給藥劑量以及蓄積系數(shù)K=LD50(n)／LD50。

2.3 臟器指數(shù)測(cè)定及生殖器官病理觀察

進(jìn)行毒性試驗(yàn)后，待解剖小鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（350 mg/kg）。解剖雄性小鼠取睪丸，雌雄小鼠取卵巢和子宮，精密電子天平稱(chēng)取各臟器質(zhì)量后于10%甲醛溶液中固定。 計(jì)算臟器指數(shù)，即臟器(mg)與活體體質(zhì)量(g)之比。 采集的組織經(jīng)過(guò)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、烘烤、脫蠟、復(fù)水、HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 新疆紫草石油醚提取物小鼠蓄積毒性試驗(yàn)結(jié)果

給藥第17 天小鼠累積死亡總只數(shù)達(dá)到10 只，累積給藥劑量為13.08 g/kg， 相當(dāng)于生藥材486.25 g/kg，蓄積系數(shù)K=3.76，根據(jù)蓄積毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]，當(dāng)K≥5 時(shí)，為弱蓄積性；當(dāng)3≤K＜5 時(shí)，為中等蓄積性；當(dāng)1≤K＜3 時(shí)，為強(qiáng)蓄積性。 結(jié)果表明新疆紫草石油醚提取物為中等蓄積毒性。

3.2 新疆紫草石油醚提取物對(duì)小鼠生殖器官臟器指數(shù)的影響

試驗(yàn)組雄性小鼠睪丸指數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而試驗(yàn)組雌性小鼠卵巢和子宮指數(shù)與對(duì)照組比均差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），表明長(zhǎng)期灌胃新疆紫草石油醚提取物對(duì)雄性小鼠睪丸組織無(wú)蓄積毒性影響，但可減輕雌性小鼠卵巢和子宮質(zhì)量。 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 新疆紫草石油醚提取物對(duì)小鼠生殖器官臟器指數(shù)的影響 （n=10，±s）

表1 新疆紫草石油醚提取物對(duì)小鼠生殖器官臟器指數(shù)的影響 （n=10，±s）

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05。

組 別對(duì)照組試驗(yàn)組給藥劑量（g/kg）—13.08睪丸指數(shù)（對(duì)）6.60±1.00 7.21±0.83卵巢指數(shù)（對(duì)）0.94±0.12 0.81±0.11*子宮指數(shù)3.49±0.23 3.14±0.28*

3.3 新疆紫草石油醚提取物對(duì)小鼠生殖器官組織形態(tài)的影響

對(duì)照組雄性小鼠睪丸生精小管內(nèi)細(xì)胞排列緊密，可見(jiàn)精原細(xì)胞、精母細(xì)胞以及大量精子細(xì)胞位于生精小管腔面，精子排列有序，睪丸間質(zhì)細(xì)胞完好。 與對(duì)照組相比試驗(yàn)組雄性小鼠睪丸病理組織觀察無(wú)明顯病變。

對(duì)照組雌性小鼠卵巢內(nèi)各級(jí)卵泡細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育正常，輪廓清晰，初級(jí)卵母細(xì)胞核大而圓，可見(jiàn)少量閉鎖卵泡。 小鼠子宮大多處在增生期或分泌期，腺體排列密集，內(nèi)膜較厚，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。 與對(duì)照組相比試驗(yàn)組小鼠卵巢內(nèi)各級(jí)卵泡細(xì)胞，卵母細(xì)胞發(fā)育正常，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常的病變，但閉鎖卵泡數(shù)目明顯增加， 小鼠子宮大多處于增生前期，腺體較少，內(nèi)膜相對(duì)對(duì)照組較薄，組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常。 表明新疆紫草石油醚提取物對(duì)試驗(yàn)組小鼠卵泡和子宮發(fā)育有一定影響，但對(duì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)均無(wú)病理性損傷。 結(jié)果見(jiàn)第72 頁(yè)彩圖圖1～3。

4 討論

石油醚是提取新疆紫草脂溶性萘醌類(lèi)成分的主要溶劑，其揮發(fā)性強(qiáng)，極性較低；且由于新疆紫草萘醌類(lèi)成分是一類(lèi)天然色素，高溫下容易變性或者分解。 因此本試驗(yàn)根據(jù)前期對(duì)新疆紫草石油醚提取工藝的考察結(jié)果[6]，采用石油醚滲漉法冷浸提取該類(lèi)成分，制得新疆紫草石油醚提取物，發(fā)現(xiàn)其得率較高且穩(wěn)定。 同時(shí)還由于該提取物不溶于水，故在進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)給藥時(shí)，用4%吐溫-80 助溶量，水浴加熱攪拌配制成混懸液給藥。

臟器指數(shù)反映藥物對(duì)臟器的影響，是初步的毒性判斷。 該指數(shù)增加表示臟器有充血、水腫、增生、肥大等變化，指數(shù)下降表示臟器萎縮、退行性變化等[5]。 臟器指數(shù)的比較結(jié)果在一定程度上可說(shuō)明藥物毒性作用的影響程度， 支持或印證病理檢查結(jié)果。 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新疆紫草石油醚提取物為中等蓄積毒性，可降低雌性小鼠卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)（卵巢和子宮質(zhì)量）， 但對(duì)雌性小鼠卵巢和子宮組織形態(tài)無(wú)毒性損害，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常；表明該提取物可能導(dǎo)致雌性小鼠生殖組織的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，從而起到抗生育作用。 這與戴德英，羅學(xué)婭發(fā)現(xiàn)紫草在抗生育藥理作用中可能使雌性小鼠的卵巢和子宮質(zhì)量下降，但對(duì)組織并無(wú)損害作用，其抑制作用是可逆的報(bào)道一致[6-7]。 究其原因可能與新疆紫草石油醚提取物干擾垂體對(duì)卵巢的調(diào)節(jié)作用，降低雌孕激素水平[8-9]，抑制小鼠卵巢內(nèi)卵泡的成熟以及子宮內(nèi)性腺的發(fā)育，使得閉鎖卵泡數(shù)目增多，子宮內(nèi)膜壁變薄，從而導(dǎo)致卵巢和子宮的質(zhì)量減輕有關(guān)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：320.

[2]戴 冰，鄒雙華.新疆紫草系統(tǒng)溶劑法提取分離部位的抗生育作用研究[J].中藥材，2007，27(9)：1 120-1 122.

[3]沈建忠.動(dòng)物毒理學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：83-102.

[4]戴 冰，周新蓓，尹愛(ài)武，等.新疆紫草四種溶媒系統(tǒng)提取物紫草素含量測(cè)定及急性毒性的試驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2005，12(3)：168-169.

[5]石東霞，楊 帆，殷中瓊，等.印楝油對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)和蓄積毒性研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（3）：317-320.

[6]戴德英，鐘 以.中醫(yī)藥和避孕抗生育[J].上海中醫(yī)藥雜志，1981，15(5)：3-5.

[7]羅學(xué)婭，李明輝，呂 莉.紫草的藥理作用與應(yīng)用研究進(jìn)展[J].大連大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(2)：80-83.

[8]馬保華，邴魯軍，王浙民.中藥紫草抗生育作用的研究[J].山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，31(1)：35.

[9]王 薇，李萍萍.紫草提取物對(duì)MCF-7 細(xì)胞及小鼠雌孕激素水平的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2003，28(11)：1 062-1 067.