“肝病實脾”法對ACLF大鼠內(nèi)毒素血癥的影響

何 琬，陳 斌*，徐嘉蔚，王國棟，劉 璇

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙410208）

研究發(fā)現(xiàn)[1]，肝衰竭大鼠存在胃腸蠕動功能障礙，促進(jìn)了腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，由此引起多種細(xì)胞因子的分泌與釋放，造成肝臟的二次損傷， 加重病情的進(jìn)展。 肝衰竭患者常伴有不同程度的腹脹、食欲不振、惡心、便秘或腹瀉等胃腸運動功能異常， 屬中醫(yī)脾虛證范疇。 我院在肝衰竭傳統(tǒng)治療方法解毒化瘀基礎(chǔ)上加用健脾益氣或健脾溫陽藥物[2-3]，臨床療效顯著，但其機(jī)制不明確。 本研究擬從胃腸動力學(xué)變化及門脈內(nèi)毒素水平，探討“肝病實脾”之解毒化瘀、益氣健脾法治療慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康Wistar 大鼠70 只，雌雄各半，體質(zhì)量120～140 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。 動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心， 飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，相對濕度55%～65%，喂普通飼料，飲冷開水。

1.2 藥物與試劑

解毒化瘀方由茵陳30 g、 虎杖30 g、 大黃10 g、丹參30 g、赤芍50 g 組成，健脾方組由黃芪30 g、白術(shù)20 g 組成，藥物均采用單味中藥配方顆粒（廣東一方制藥有限公司），谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒（長春匯力生物技術(shù)有限公司）；谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒（長春匯力生物技術(shù)有限公司）；顯色基質(zhì)鱟試劑盒 （廈門市鱟試劑實驗廠有限公司， 批號：140325）；牛血清白蛋白（北京Solarbio 公司，批號：628C053）；弗氏不完全佐劑（美國Sigma-Aldrich，批號：1001646388）；D-氨基半乳糖（美國Sigma）；羧甲基纖維素（美國Sigma）；水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），大鼠胃動素（motilin，MTL）ELISA試劑盒（美國RD 公司，批號：20140919）。

1.3 主要儀器

JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) （寧波新芝技術(shù)公司），SK3003 半自動生化分析儀（深圳市盛信康科技有限公司），722 s 可見光分光度計 （上海精密科學(xué)儀器有限公司制造）；電子天平ME2001E/02[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.4 溶液的制備

1.4.1 營養(yǎng)性半固體糊[4]取羧甲基纖維素5 g，溶于125 mL 蒸餾水中，然后依次加入奶粉8 g、白糖4 g、淀粉4 g，且每加1 次攪拌1 次，攪拌均勻后，再加入活性炭1.5 g， 攪拌均勻， 最后配制成約150 mL 含150 g 的營養(yǎng)半固體糊。 置4 ℃冰箱冷藏，用前2 h 取出，恢復(fù)至室溫。

1.4.2 牛血清白蛋白乳化液[5]牛血清白蛋白液：取牛血清白蛋白5 g，加生理鹽水5 mL，混勻配為1000 mg/mL。 取0.5 mL （500 mg） 加入生理鹽水30.75 mL，配成31.25 mL。乳化：取上述牛血清白蛋白液20 mL（320 mg）與弗氏不完全佐劑20 mL 置燒杯內(nèi)，在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上乳化，至液滴入水不散開，成乳化液（含牛血清白蛋白8 mg/mL）。

1.5 動物造模與給藥

參照文獻(xiàn)方法[5-7]，并加以改進(jìn)。 70 只Wistar 大鼠，雌雄各半，分為4 組：正常組10 只，其余60 只隨機(jī)分成3 組制作免疫性肝纖維化模型。 （1）牛血清白蛋白致敏：除正常組外，每次取0.5 mL 乳化液大鼠皮下多點注射， 第1-2 次間隔14 d， 第2-3 次、3-4次間隔10 d。 （2）牛血清白蛋白攻擊：每周2 次尾靜脈注射牛血清白蛋白，劑量每次0.4 mL/只，牛血清白蛋白含量自2 mg/次漸加0.5 mg/次至4 mg/次，維持此劑量，共6 周（12 次），成模35 只，分別是模型組10 只，對照組12 只，實驗組13 只。 （3）急性攻擊：6周末， 除正常組外， 均予以D-氨基半乳糖1.2 g/kg一次性腹腔注射，建立慢加急性肝衰竭模型。

采取灌胃給藥方法，按照人與大鼠體表面積的換算關(guān)系，計算出大鼠健脾方的日用量4.5 g/kg，實驗組（解毒化瘀+健脾）的日用量18 g/kg、對照組(解毒化瘀)的日用量13.5 g/kg。實驗組在尾靜脈牛血清白蛋白攻擊的同時開始健脾藥物灌胃給藥，至處死前7 d 加用解毒化瘀顆粒，用藥時間為6 周；對照組于動物處死前7 d 開始灌胃解毒化瘀顆粒；正常組與模型組大鼠給予等劑量生理鹽水， 于處死前7 d 開始灌胃給藥； 以上各組均每天灌胃1 次，3 mL/次。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 內(nèi)毒素檢測 抽取門靜脈血1 mL 裝入無熱原抗凝管，3 000 r/min，離心2 min，取上清血漿標(biāo)本，參照顯色基質(zhì)鱟試劑盒說明書，行內(nèi)毒素檢測。

1.7.2 血清MTL 濃度檢測 抽取右心房血2 mL，注入促凝管中，3 000 r/min，離心4 min，取血清，行酶聯(lián)免疫吸附檢測。

1.7.3 胃排空率、小腸推進(jìn)率的測定[4，8]大鼠末次給藥后禁食不禁水16 h， 予營養(yǎng)性半固體糊灌胃2 mL/只，30 min 后， 用4%水合氯醛以 0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉。 迅速打開腹腔，分離腸胃。 結(jié)扎胃賁門和幽門，取胃，用濾紙吸干后稱全質(zhì)量，然后沿胃大彎剪開胃體， 用蒸餾水洗去胃內(nèi)容物后，拭干，稱凈質(zhì)量。 以胃全質(zhì)量和胃凈質(zhì)量之差為胃內(nèi)殘留物質(zhì)量，計算胃內(nèi)殘留物占所灌半固體米糊的質(zhì)量百分比為胃內(nèi)殘留率。 同時迅速取出小腸，輕輕剝離后直鋪于試驗臺白紙上，不牽拉，用直尺測量幽門至回盲腸部全長及幽門至黑色半固體糊前沿的距離，并計算小腸推進(jìn)率。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組實驗數(shù)據(jù)以“±s”表示。 多組間計數(shù)資料比較采用方差分析， 兩組間比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平的比較

與正常組相比，模型組大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平顯著升高，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)；實驗組大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平與模型組、對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 見表1。

2.2 各組大鼠血漿胃動素水平的比較

模型組MTL 降低，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01)。實驗組大鼠MTL 水平與模型組、對照組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 見表1。

表1 各組大鼠內(nèi)毒素、胃動素水平比較 （±s）

表1 各組大鼠內(nèi)毒素、胃動素水平比較 （±s）

注：與正常組比較△△P＜0.01；與模型組比較**P＜0.01；與對照組比較##P＜0.01。 下表同。

組 別正常組模型組對照組實驗組n 10 10 12 13內(nèi)毒素(EU/mL)0.572±0.189 5.774±1.636△△5.463±0.688 3.972±0.834**##胃動素(ng/L)140.15±11.02 45.42±3.70△△47.23±5.05 61.85±6.5**##

2.3 各組大鼠胃內(nèi)殘留率和小腸推進(jìn)率的比較

與正常組相比，模型組大鼠的胃內(nèi)殘留率顯著升高，小腸推進(jìn)率顯著下降(P＜0.01)；說明造模后各組大鼠胃排空時間延長，小腸推進(jìn)功能緩慢；實驗組與模型組、對照組比較，大鼠胃內(nèi)殘留率下降，小腸推進(jìn)率顯著升高(P＜0.01)。 見表2。

表2 各組大鼠胃殘留率、小腸推進(jìn)率比較 （±s）

表2 各組大鼠胃殘留率、小腸推進(jìn)率比較 （±s）

組 別正常組模型組對照組實驗組n 10 10 12 13胃殘留率(%)57.85±15.08 78.15±11.92△△73.33±13.36 62.12±13.30**##小腸推進(jìn)率(%)57.38±5.72 32.39±8.4△△36.56±8.68 52.45±12.52**##

3 討論

生理上肝依五行關(guān)系而克脾土，病理上肝郁可橫逆犯脾，土虛也可導(dǎo)致木侮，脾臟易虛，脾虛失運，土壅木郁，肝氣失于條達(dá)，血行不暢，同時易致濕、熱、疫毒等外邪內(nèi)侵，留滯不去，導(dǎo)致了疾病的發(fā)生，正如李東垣在《脾胃論·脾胃盛衰論》中說“百病皆由脾胃衰而生也。 ”陳復(fù)正《幼幼集成》中曰：“益脾土強(qiáng)者，足以捍御濕熱，必不生黃，惟其脾虛不運，所以濕熱乘之。 ”因此，在治療肝病的時候，就應(yīng)當(dāng)先實其脾氣，以免肝邪犯脾，導(dǎo)致疾病進(jìn)一步發(fā)展。 所謂 “正氣存內(nèi)，邪不可干”，從胃腸著眼，“正氣存內(nèi)”則主要體現(xiàn)在胃氣健旺、小腸分清別濁和大腸通降正常，亦即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所說的胃腸正常結(jié)構(gòu)與功能[9]。 因此治療肝衰竭時在傳統(tǒng)治療方法解毒化瘀基礎(chǔ)上加用健脾益氣或健脾溫陽藥物，可使臨床療效顯著提高。

肝衰竭時，由于腸道菌群紊亂，細(xì)菌異常增殖，內(nèi)毒素產(chǎn)生增多，肝臟發(fā)生大面積壞死，Kuffer 細(xì)胞功能嚴(yán)重受損， 對內(nèi)毒素的清除和解毒能力減弱，易致內(nèi)毒素血癥，激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，釋放大量的炎性介質(zhì)(如TNF-α 等)和氧自由基，導(dǎo)致胃腸黏膜的缺血、缺氧和血管通透性增加，造成血液循環(huán)障礙、腸黏膜水腫，蠕動減慢、消化吸收功能障礙，加重腸源性內(nèi)毒素血癥的產(chǎn)生，反過來又加重肝衰竭的進(jìn)展。 本研究結(jié)果也證實了ACLF 大鼠存在胃腸功能障礙，胃動素水平下降和腸源性內(nèi)毒素血癥（intestinal endotoxemia，IETM）。

本實驗結(jié)果證實，解毒化瘀法經(jīng)早期加用健脾藥物黃芪、白術(shù)干預(yù)后，能使ACLF 大鼠胃動素含量增多，胃內(nèi)殘留率顯著下降、小腸推進(jìn)率顯著升高，結(jié)果表明“肝病實脾”能促使胃排空和小腸推進(jìn)，增加腸道的推進(jìn)式蠕動可以防止腸腔內(nèi)容物的瘀滯和細(xì)菌的過度生長，減少致病菌及內(nèi)毒素對腸黏膜屏障的損傷，加快腸道內(nèi)毒素的排出，從而改善IETM，及減輕內(nèi)毒素對肝臟的損傷。本實驗結(jié)果證實了“肝病傳脾”，致脾運化功能失常(胃排空、小腸推進(jìn)率降低)，濕毒內(nèi)蘊(包括血中內(nèi)毒素增加)，損及于肝。 因此，選擇用中藥來維持和恢復(fù)胃腸正常結(jié)構(gòu)與功能可以從健脾益氣、“肝病實脾”的角度著手治療。 本研究結(jié)果將為“肝病實脾”早期干預(yù)ACLF 提供理論與實驗依據(jù)， 也為中醫(yī)治療ACLF 提供一種全新的研究思路。

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