不同產(chǎn)地人工栽培黃花石蒜不同器官中加蘭他敏含量測定

劉湘丹，王 姣，李鳳娟，周日寶*，王朝暉，劉笑蓉

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙410208）

黃花石蒜（Lycoris aurea Herb.），又名忽地笑，為石蒜科（Amaryllidaceae）石蒜屬（Lycoris）的草本植物[1]。 其含有多種生物堿，如石蒜堿、加蘭他敏、力可拉堿等，其中加蘭他敏（Galanthamine）是一種可逆性膽堿酯酶抑制劑，易透過血腦屏障，產(chǎn)生較強(qiáng)的中樞作用，可用于重癥肌無力、進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良、脊髓灰質(zhì)炎后遺癥及老年癡呆癥的治療，是目前臨床上治療老年癡呆癥的首選藥[2-4]。

黃花石蒜鱗莖因含有較高的生物堿，是目前提取加蘭他敏等生物堿的主要原料，藥廠長期大量采挖野生黃花石蒜鱗莖，致野生資源瀕臨枯竭；同時，產(chǎn)地山丘也被挖得千瘡百孔，造成水土流失，環(huán)境破壞嚴(yán)重。

本文充分利用人工栽培黃花石蒜的資源，尋找高含量的藥材原料，探索黃花石蒜中加蘭他敏的最佳采收部位及最適種植區(qū)。 現(xiàn)將方法與結(jié)果報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 LC 高效液相色譜儀 （含二元泵、柱溫箱、手動進(jìn)樣器、紫外檢測器）（安捷倫科技有限公司）；JY3002 電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料

黃花石蒜植物全株分別于2013年7月采自湖南省南岳衡山、瀏陽市大圍山、湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥植園的人工栽培黃花石蒜基地。 將黃花石蒜花、花葶、鱗莖和根分別于60 ℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎，過60目篩，備用。

1.3 試劑

加蘭他敏對照品(南京澤朗醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，純度為99%)；95%乙醇、氨水、鹽酸、甲醇、磷酸、三氯甲烷均為分析純；重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取加蘭他敏對照品5.0 mg 和7.0 mg，分別置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解，并定容，即得0.500 mg/mL 和0.700 mg/mL的加蘭他敏對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備[5-6]取黃花石蒜花和根(花葶和鱗莖)粉末各約1.0 g（各約5.0 g)，精密稱定，加95%乙醇50 mL，水浴加熱回流1 h，提取2 次， 過濾， 合并濾液， 水浴揮干， 殘渣加0.1 mol/L 鹽酸25 mL 溶解，過濾，濾液加氨水調(diào)至pH 9.0， 以三氯甲烷萃取3 次， 每次25 mL，合并萃取液，水浴揮干，殘渣加甲醇溶解，定容至10 mL，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相0.1%磷酸-甲醇(92∶8)；流速1.0 mL/min；檢測波長238 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。 在本色譜條件下，各供試品溶液中加蘭他敏可與相鄰峰分離良好，峰形對稱，保留時間均約為12.0 min。 對照品、衡山黃花石蒜花、根、花葶、鱗莖樣品HPLC 圖見圖1。

圖1 加蘭他敏對照品溶液和衡山黃花石蒜各部位供試品溶液的HPLC 圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍考察 分別精密量取對照品溶液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL， 用甲醇定容至5 mL 量瓶中(加蘭他敏濃度分別為25、50、75、100、125、150 μg/mL)， 用0.45 μm 微孔濾膜過濾后，分別精密量取10 μL 注入液相色譜儀， 記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程為：Y=3.371X-8.99(r=0.999 9)表明加蘭他敏對照品溶液的濃度在25～150 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密量取75.0 μg/mL 對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定，得加蘭他敏峰面積的RSD 為0.7%（n=6），表明實驗儀器的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 分別精密量取同一供試品溶液10 μL 于2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣，測定，得加蘭他敏峰面積的RSD 為1.9%（n=6），表明供試溶液中加蘭他敏在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 分別取南岳衡山黃花石蒜花和鱗莖粉末各約1.0 g 和5.0 g，精密稱定，各平行6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，精密量取10 μL 進(jìn)樣，測定，計算花(鱗莖)中加蘭他敏的平均含量為0.135%(0.0204%)， 其RSD 值為1.7%(1.9%)（n=6），表明本方法的重復(fù)性好。

2.3.5 回收率試驗 取已知加蘭他敏含量的南岳衡山黃花石蒜(鱗莖) 粉末約0.5 g（約2.5 g），精密稱定， 各平行6 份， 花和鱗莖樣品分別加入0.700 mg/mL 和0.500 mg/mL 的加蘭他敏對照品溶液1 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，并分別進(jìn)行測定，記錄峰面積，結(jié)果見表1。

表1 黃花石蒜花的加樣回收率測定結(jié)果

2.4 樣品含量測定結(jié)果

分別取黃花石蒜各組樣品， 各平行2 份，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液。 分別精密量取10 μL 進(jìn)樣，測定。 計算加蘭他敏的平均含量，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地人工栽培黃花石蒜各器官中加蘭他敏含量比較 （%）

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

將黃花石蒜不同器官、不同產(chǎn)地和加蘭他敏含量三個變量用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析， 分析結(jié)果見表3，所選Corrected Model（模型檢驗）具有顯著統(tǒng)計意義(P=0.000＜0.001)，黃花石蒜不同器官加蘭他敏的含量差別也具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000＜0.001)，其含量由高到低依次為：花＞根＞花葶＞鱗莖；不同產(chǎn)地黃花石蒜中加蘭他敏含量差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 不同器官、不同產(chǎn)地與加蘭他敏含量方差分析結(jié)果

3 討論

3.1 黃花石蒜不同器官中加蘭他敏含量比較

從表3 中數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果可以看出，器官欄中P=0.000＜0.001，說明人工栽培黃花石蒜各器官中加蘭他敏含量存在非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。 從表2可知，不同器官中加蘭他敏含量差別大，花中含量最高，而鱗莖中最低，前者約為后者的8 倍。 而在不同產(chǎn)地的同一器官中加蘭他敏含量差別很小，花中差別最小(RSD=2.4%，n=3)，鱗莖中差別最大(RSD=18%，n=3)。 各器官加蘭他敏含量高低依次為： 花＞根＞花葶＞鱗莖，提示黃花石蒜中加蘭他敏含量主要集中在花中， 且其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其傳統(tǒng)入藥部位地下鱗莖中含量。

傳統(tǒng)方法往往靠采挖野生黃花石蒜地下鱗莖提取加蘭他敏的原料，僅具一次性收益，生產(chǎn)成本高，采挖野生黃花石蒜鱗莖的勞動強(qiáng)度大，且勞務(wù)費用成本高。 如以人工栽培黃花石蒜的花作為提取加蘭他敏的藥材原料，其可連續(xù)多年采收，投入少，長期性收益，勞動強(qiáng)度小，生產(chǎn)成本及勞務(wù)費用成本低。 結(jié)合黃花石蒜鱗莖和花中加蘭他敏的平均含量及采收特點進(jìn)行綜合比較分析得出，以采收黃花石蒜花作為加蘭他敏的藥材原料具有更廣闊前景。

3.2 人工栽培黃花石蒜不同產(chǎn)地中加蘭他敏含量比較

從表3 中數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地樣本中加蘭他敏含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），說明三個產(chǎn)地人工栽培黃花石蒜各相同器官中加蘭他敏含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

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