MCM2與Cx43蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá)和臨床意義

卿 蕊，范自力*，黃澤智，姜艷紅，肖 盛，楊 秦

（1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院血液科，湖南 長沙410013；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院病理科，湖南 長沙410013；3.邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校檢驗系，湖南 邵陽422000）

非霍奇金淋巴瘤 （non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）是一組起源于血液淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤。因其臨床表現(xiàn)多樣、病理類型復(fù)雜、異質(zhì)性明顯，嚴(yán)重危害人類健康而成為當(dāng)前腫瘤研究的一個熱點。 微小染色體維持蛋白2（Minichromosome maintenance proteins 2，MCM2）是一種重要的DNA 復(fù)制啟動子[1]。 在DNA 復(fù)制的起始和延伸過程中起著重要作用。 細(xì)胞間隙連接蛋白43（Connexin 43，Cx43）是一種存在于細(xì)胞之間的通道蛋白，它負(fù)責(zé)細(xì)胞之間物質(zhì)及信息的交換，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著抑制調(diào)控作用[2]。 Ki-67是一種核蛋白抗原，是目前公認(rèn)能反映細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)，可用于判斷淋巴瘤惡性程度及預(yù)后[3]。 本研究采用免疫組織化學(xué)方法（SP 法）檢測60 例NHL組織中MCM2、Cx43 蛋白的表達(dá)情況， 并分析其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)一步探討它們與NHL發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2013年10月至2014年10月在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實為非霍奇金淋巴瘤患者組織標(biāo)本60 例及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)患者（reactive hyperplasia of lymph node，RH）組織標(biāo)本20 例。 所有標(biāo)本均由本院兩位病理科高年資醫(yī)生行蠟塊切片復(fù)查， 所選標(biāo)本病例診斷明確符合WHO[4]標(biāo)準(zhǔn)。 60 例NHL 患者中，男34 例，女26 例；年齡12～86 歲，中位年齡52.6 歲；惰性NHL（低度惡性）14 例，包括濾泡性淋巴瘤2 例、黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤6 例、小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤4 例、淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤2 例；侵襲性NHL（中高度惡性）46 例，包括彌漫大B 細(xì)胞性淋巴瘤36 例、 漸變性大B 細(xì)胞性淋巴瘤2 例、 血管免疫母T 細(xì)胞淋巴瘤2 例、NK/T 細(xì)胞淋巴瘤2 例、外周T 細(xì)胞淋巴瘤4 例。 所有患者均為初治患者，均通過手術(shù)或影像檢查確定腫瘤侵犯部位。 采用Ann Arbor 分期系統(tǒng)[5]分期，按國際工作分型，經(jīng)形態(tài)及免疫組化反應(yīng)區(qū)分T、B 細(xì)胞亞型，按全身癥狀分組。

1.2 試劑與儀器

兔抗人MCM2 多克隆抗體（10513-1-AP）、兔抗人Cx43 多克隆抗體（15386-1-AP），稀釋倍數(shù)均為1∶50，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。二抗為快捷型酶標(biāo)羊抗兔IgG 聚合物，DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司， 二甲苯、乙醇、3%H2O2、 枸櫞酸鈉等常規(guī)試劑購自北京化學(xué)試劑公司。 YD-315 切片機(jī)（浙江金華益迪試驗器材），BA2T 顯微鏡（Motic），BMJ-A 包埋機(jī)（常州中威電子儀器）。

1.3 實驗方法

蠟塊包埋標(biāo)本連續(xù)切片4 μm， 防脫撈片，60 ℃烤片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，微波爐抗原修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，加一抗4 ℃過夜孵育，PBS 液洗5 min×3 次，加二抗37 ℃孵育30 min，PBS 液洗5 min×3 次，DAB顯色1～5 min，蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染胞核，鹽酸酒精分化，流動自來水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。以PBS液替代一抗作陰性對照，以正常淋巴結(jié)組織的陽性切片作陽性對照。

1.4 結(jié)果判定

MCM2 的陽性染色部位為細(xì)胞核，Cx43 的陽性染色部位為細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)。 在染色均勻的區(qū)域，選取5個(上、下、左、右、中)高倍鏡視野（×400）：（1）按陽性細(xì)胞百分率（A 值）評分：1%～25%為1 分，25%～50%為2 分，＞50%為3 分；（2）按染色強(qiáng)度（B 值）評分：不著色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。 綜合A+B 值判斷結(jié)果。 陰性（-）為0 分，弱陽性（+）為1～2 分，中度陽性（++）為3～4分，強(qiáng)陽性（+++）為5～6 分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0 版軟件進(jìn)行處理。 組間率的比較用χ2檢驗計數(shù)資料分析， 相關(guān)性分析用Pearson等級相關(guān)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NHL 和RH 組織中MCM2、Cx43 蛋白的表達(dá)

MCM2 為胞核表達(dá)，Cx43 為胞膜、胞質(zhì)表達(dá)。 陽性染色均是棕黃（褐）色顆粒或團(tuán)塊。 MCM2 在NHL中陽性表達(dá)率為86.67%（52/60）明顯高于在RH 組織中的25.00%（5/20），Cx43 在NHL 組織中的陽性表達(dá)率是20.00%(12/60) 明顯低于在RH 組織中的60.00%（12/20）， 比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）。 見表1。

2.2 MCM2、Cx43 蛋白在NHL 中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

NHL 中MCM2 的表達(dá)與惡性程度、 臨床分期、Ki-67 水平有關(guān)（P＜0.01 或P＜0.05），而與性別、年齡、全身癥狀、免疫分型無關(guān)（P＞0.05）；NHL 中Cx43 的表達(dá)與惡性程度有關(guān)（P＜0.01），而與性別、年齡、全身癥狀、免疫分型、臨床分期、Ki-67 水平無關(guān)（P＞0.05）。 見表2、封三彩圖1～2。 表明MCM2 的過度表達(dá)、Cx43 的低水平表達(dá)均與NHL 的惡性程度密切相關(guān)。

表1 MCM2、Cx-43 蛋白在NHL 和RH 組織中的表達(dá) （例）

表2 MCM2、Cx43 蛋白表達(dá)與NHL 患者臨床病理特征的相互關(guān)系 （例）

60 例NHL 中MCM2、Cx43 蛋白的表達(dá)相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.05，P=0.80）。 可能由于本研究觀察樣本較少，觀察周期短等因素所致。

3 討論

腫瘤發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)是細(xì)胞異常增殖，而細(xì)胞增殖決定于細(xì)胞周期， 細(xì)胞周期受DNA 復(fù)制的調(diào)控， 所以檢測DNA 復(fù)制起始相關(guān)蛋白可預(yù)測腫瘤的發(fā)生。 MCM 家族就是DNA 復(fù)制起始調(diào)控蛋白之一。MCM2 是其家族的一員，它是近年來發(fā)現(xiàn)的一種能較好地反映細(xì)胞增殖活性程度的指標(biāo)。 它在細(xì)胞處于分化成熟或靜止期含量較少， 而在增殖、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，MCM2 含量從G0 期開始增加，到G1 末期和S 早期達(dá)到高峰，并與染色質(zhì)結(jié)合，在S期至M 期成為游離的MCMC2，G2 期與M 期降低。由于這種與細(xì)胞增殖過程相一致的周期性變化，目前已將它視為S 細(xì)胞的標(biāo)記物[6]，被認(rèn)為是特異性增殖相關(guān)因子癌前標(biāo)記[7]，是研究細(xì)胞能動性及評估腫瘤預(yù)后的較好指標(biāo)。大量文獻(xiàn)報道，MCM2 在各種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。 Mukherjce 等[8]采用免疫組化研究發(fā)現(xiàn)MCM2 陽性表達(dá)率與病理結(jié)果完全一致。Koto 等[9]研究表明MCM2 在食管鱗癌中的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、病理分期、組織學(xué)分級等有關(guān)。 本研究發(fā)現(xiàn)，MCM2 在NHL 組織中陽性率表達(dá)顯著高達(dá)86.67%，而在RH 組織中陽性率僅為25%，且MCM2在NHL 中的陽性率隨著惡性程度、臨床分期及Ki-67 水平升高而升高， 說明MCM2 在癌細(xì)胞中的DNA 復(fù)制起點較多， 提示MCM2 高表達(dá)與NHL 發(fā)生密切相關(guān)。

細(xì)胞間隙連接通訊 （gap junction intercellular communication，GJIC） 是細(xì)胞間的重要連接方式，其基本結(jié)構(gòu)單位是Cx，人類編碼Cx 基因有21 種，其中Cx43 是最廣泛最充足表達(dá)的間隙蛋白[10]，它在間隙連接介導(dǎo)的GJIC 方面發(fā)揮著重要作用。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，Cx43 表達(dá)異常和GJIC 功能缺陷與多種腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)化密切相關(guān)， 表現(xiàn)為表達(dá)水平下調(diào)[11]。例如膠質(zhì)瘤[12]、肺癌[13]、乳腺癌[14]、前列 腺癌[15]等普遍存在Cx43 的表達(dá)降低或缺失，但目前少見其與NHL關(guān)系的文獻(xiàn)報道。 本研究Cx43 在NHL 中的表達(dá)水平較RH 中的明顯降低，說明Cx43 的低表達(dá)與NHL癌變密切相關(guān)，可視為癌前病變的早期事件。

本研究發(fā)現(xiàn)二者無明顯相關(guān)，可能由于本研究觀察樣本較少，觀察周期短等因素，結(jié)果有待后續(xù)研究證實。 但前者為高表達(dá)而后者為低表達(dá)是明確的， 且MCM2 的過度表達(dá)與Cx43 的低水平表達(dá)與NHL 的惡性程度密切相關(guān)。

綜上所述，MCM2 蛋白在細(xì)胞增殖過程中起著關(guān)鍵作用，檢測NHL 組織中的MCM2 蛋白表達(dá)，能反映NHL 的惡性程度， 具有潛在的臨床應(yīng)用價值；而Cx43 作為一種腫瘤抑制因子， 臨床檢測能作為NHL 預(yù)防的參考指標(biāo)。 作為細(xì)胞周期重要的調(diào)控蛋白，MCM2 和Cx43 的聯(lián)合檢測，將有助于NHL 的早期診斷及預(yù)后的參考。 隨著后續(xù)研究的深入，MCM2有望成為NHL 治療上的新靶點。

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