攜帶肝細(xì)胞生長因子基因的減毒沙門菌促血管形成的實(shí)驗(yàn)研究

哈小琴，郭馨云，葛秀潔，楊迎桂，朱曉紅，張萍，楊淑娟，薛榮利，張媛媛，肖娜娜

·論著·

攜帶肝細(xì)胞生長因子基因的減毒沙門菌促血管形成的實(shí)驗(yàn)研究

哈小琴，郭馨云，葛秀潔，楊迎桂，朱曉紅，張萍，楊淑娟，薛榮利，張媛媛，肖娜娜

目的 探討攜帶肝細(xì)胞生長因子（HGF）基因的減毒沙門菌體外促血管形成的效應(yīng)。

方法 構(gòu)建攜帶 HGF 基因真核表達(dá)載體的減毒沙門菌菌株（TPH），體外轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）后觀察目的基因表達(dá)及其增殖活性；評價(jià) TPH 的細(xì)胞表達(dá)上清對雞胚絨膜尿囊膜血管生成效應(yīng)的刺激效應(yīng)。

結(jié)果 構(gòu)建的 TPH 菌株在體外可有效轉(zhuǎn)染 HUVEC 并表達(dá)有活性的 HGF 蛋白，6 × 105個(gè) HUVEC 細(xì)胞可表達(dá)160～190 ng 的 HGF 蛋白，和對照組相比，TPH 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表達(dá)上清可明顯促進(jìn) HUVEC 增殖，而且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系；TPH 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表達(dá)上清也刺激雞胚絨膜尿囊膜小血管生成，其血管數(shù)量（133.0 ± 11.5）/cm2明顯大于轉(zhuǎn)染 TP 的 HUVEC 細(xì)胞上清組（83.3 ± 5.5）/cm2和對照組（62.7 ± 7.1）/cm2（P ＜ 0.05）。

結(jié)論 攜帶 HGF 基因的減毒沙門菌可有效轉(zhuǎn)染 HUVEC并促進(jìn)細(xì)胞增殖，刺激小血管新生，可能在組織創(chuàng)面愈合中起重要作用，在胃潰瘍治療中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

肝細(xì)胞生長因子；基因轉(zhuǎn)移技術(shù)；血管生成誘導(dǎo)劑；轉(zhuǎn)化，細(xì)菌；減毒沙門菌

血管發(fā)生或新生在胚胎器官的發(fā)育、出生后創(chuàng)面?zhèn)谟霞岸喾N病理情況下都起著非常關(guān)鍵的作用［1-3］。近年來研究表明，生長因子在細(xì)胞的增殖、遷移、損傷修復(fù)、潰瘍愈合及免疫調(diào)節(jié)等方面起重要作用，已有研究表明，肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一種多功能生物因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新血管形成作用，還可促進(jìn)組織細(xì)胞的再生、抑制細(xì)胞凋亡，可以調(diào)節(jié)炎癥、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合［4-5］。胃潰瘍是一種常見消化道疾病，其病程常反復(fù)且遷延不愈，而上皮化和血管形成是胃潰瘍愈合必不可少的過程，因此，本研究依據(jù)胃潰瘍愈合過程原理，構(gòu)建了攜帶 HGF 基因真核表達(dá)載體的減毒的沙門菌菌株（TPH），該菌株具有以下優(yōu)勢和特點(diǎn)：①采用的是基因治療方法，使局部轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的真核細(xì)胞作為一“微型藥物工廠”持續(xù)一定時(shí)間分泌表達(dá) HGF 活性蛋白；②利用 HGF的多功能修復(fù)作用，促血管形成；③減毒沙門菌是一良好的口服基因傳遞載體［6］，對胃腸黏膜組織有親嗜作用［7］，有望發(fā)展成一種口服基因治療藥物；④HGF 已證明可抑制瘢痕［8］，可減少愈合后的潰瘍瘢痕，可能阻止并發(fā)癥的發(fā)生。從而認(rèn)為該菌株可能具有促進(jìn)胃潰瘍愈合的作用。

本文旨在探討構(gòu)建的 TPH 的促血管形成效應(yīng)，為其促進(jìn)胃潰瘍創(chuàng)面愈合機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胎盤 cDNA 文庫、pSK 購自美國 Clontech公司；pEGFP-N1 及 pcDNA3 為本室保存；瓊脂糖、Taq 酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、核酸凝膠回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母提取物及蛋白胨購自美國Merck 公司；Ty21a 菌株為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購自美國模式菌種收集中心（ATCC）；DMEM 和胎牛血清購自美國Gibco 公司；抗人 HGF 單克隆抗體、重組人 HGF蛋白純品購自美國 R&D 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 購自美國 Santa Cruz Biotechnology公司；孵育第 13 天的雞胚購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所；M450 甲基纖維素購自美國 Sigma 公司；Multiporator 4308 型電轉(zhuǎn)儀購自德國 Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 攜帶 HGF 基因減毒沙門菌菌株的構(gòu)建

1.2.1.1 攜帶人 HGF 基因的真核表達(dá)載體pcK-HGF 的構(gòu)建 按人 HGF cDNA 序列設(shè)計(jì)引物，正向引物序列為 5' ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaa actc 3'，反向引物序列為 5' tgggatccgcggccgcctatgact gtggtacctt 3'。從人胎盤 cDNA 文庫克隆人 HGF cDNA（約 2.2 kb）。并將 HGF 基因的 PCR 產(chǎn)物克隆至 pSK 載體的 BamH I 和 Sal I 酶切位點(diǎn)中，命名為 pSK-HGF。將 pcDNA3 載體用 Ssp I及 Avr II 雙酶切，回收大片段（約 4.9 kb），pEGFP-N1 用 Avr II 酶切，回收小片段（卡那霉素基因，1.1 kb），用 T4 DNA 連接酶將回收的大小片段連接，獲得卡那霉素抗性的 pcDNA3 載體，以避免患者青霉素過敏，命名為 pcK。分別用BamH I 和 Apa I 雙酶切 pcK 及 pSK-HGF，回收大片段及小片段，用 T4 DNA 連接酶連接，獲得攜帶人 HGF 基因的含卡那霉素抗性基因的真核表達(dá)載體，命名為 pcK-HGF。

1.2.1.2 真核表達(dá)質(zhì)粒 pcK-HGF 電穿孔轉(zhuǎn)化減毒沙門菌 將減毒沙門菌 Ty21a 接種于 LB 培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，低溫 4000 r/min離心收集菌體，用預(yù)冷的無菌去離子水洗滌細(xì)胞2 次后重懸。用電轉(zhuǎn)儀將 pcK-HGF 和 pcK 質(zhì)粒各 0.2 μg 轉(zhuǎn)入 200 μl 預(yù)處理的 Ty21a。37 ℃ 輕柔振蕩培養(yǎng) 45 min 后涂布于含卡那霉素（100 mg/L）固體 LB 培養(yǎng)基平皿繼續(xù)培養(yǎng)，次日挑取菌落進(jìn)行鑒定。

1.2.1.3 陽性工程菌的篩選 從培養(yǎng)板挑取單菌落分別接種于含卡那霉素 LB 培養(yǎng)液中，37 ℃ 振搖培養(yǎng)。轉(zhuǎn)入 pcK-HGF 的減毒沙門菌陽性菌株的篩選通過卡那霉素抗性、PCR（利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動子 CMV 及目的基因 HGF）及提取質(zhì)粒后 BamH I/Apa I 雙酶切鑒定；轉(zhuǎn)入 pcK的減毒沙門菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性及PCR 篩選（利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動子CMV）。CMV 擴(kuò)增引物：5' cccagtacatgaccttatggg 3'，5' ggagacttggaaatccccgt 3'。HGF 擴(kuò)增引物：5' ccatcga tgttaacatgtgggtgaccaaactc 3'，5' tgggatccgcggccgcctatg actgtggtacctt 3'。

1.2.2 重組減毒沙門菌活性觀察

1.2.2.1 重組減毒沙門菌轉(zhuǎn)染 HUVEC 將HUVEC 接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 6 × 105個(gè)細(xì)胞，次日用無抗生素 DMEM 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 2 次，分別將 1 × 108cfu 攜帶 pcK 和攜帶pcK-HGF 質(zhì)粒的減毒沙門菌加入 HUVEC 細(xì)胞中，37 ℃ 共孵育 30 min，用含慶大霉素（50 mg/L）的無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃ 孵育 4 h 后加入四環(huán)素至終濃度為 10 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 收集細(xì)胞上清，用雙抗夾心ELISA 法檢測上清中 HGF 的表達(dá)水平。一抗為抗人 HGF 單克隆抗體（1 μg/ml），二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG，用新鮮配制的 OPD 底物顯色液顯色，同時(shí)用重組人HGF 標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計(jì)算上清中 HGF的表達(dá)量。

1.2.2.2 HGF 表達(dá)上清對 HUVEC 的作用分析 采用 MTT 法測定細(xì)胞增殖活性。將 HUVEC接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù) 5 × 103個(gè)。12 h 后吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入 100 μl 無血清 DMEM，HGF 表達(dá)上清所加的量分別含HGF 100、200、400、800、1600 pg。72 h 后每孔加入 20 μl MTT，37 ℃ 孵育 4 h 后，棄上清，用DMSO 溶解沉淀，測其在 560 nm 波長處吸光度（A）。

1.2.2.3 HGF 表達(dá)上清對雞胚絨膜尿囊膜血管刺激作用觀察 采用我們前期報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法制備甲基纖維素碟［9］。實(shí)驗(yàn)分三組：轉(zhuǎn)染攜帶pcK-HGF 質(zhì)粒的減毒沙門菌的 HUVEC 細(xì)胞上清組（HGF 表達(dá)產(chǎn)物 800 pg）、轉(zhuǎn)染攜帶 pcK 質(zhì)粒的減毒沙門菌的 HUVEC 細(xì)胞上清組（同體積上清）及對照組（同體積轉(zhuǎn)染 PBS 的 HUVEC 細(xì)胞上清），分別將三組上清加入甲基纖維素碟內(nèi)，每組 6 胚，按操作程序進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作［8］。之后按文獻(xiàn)［9］方法計(jì)數(shù)每組以甲基纖維素碟為中心周圍 1 cm2輻射出新生小血管的數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 攜帶 HGF 基因減毒沙門菌菌株 TPH 的構(gòu)建

2.1.1 HGF 表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 對 PCR 所得HGF cDNA 測序結(jié)果表明，其序列與 GenBank 已公布的人 HGF cDNA 序列（M60718.1）完全一致?？寺≈琳婧吮磉_(dá)載體 pcK 后采用限制性內(nèi)切酶及抗生素抗性鑒定。用 BamH I 和 Apa I 雙酶切后可在瓊脂糖凝膠電泳圖上見一約 2.2 kb 的 DNA 片段（圖1），質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后可在含卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)板上生長轉(zhuǎn)化子克隆。表明我們成功構(gòu)建了HGF 的表達(dá)質(zhì)粒 pcK-HGF。

2.1.2 陽性工程菌的篩選 工程菌可在含卡那霉素的 LB 瓊脂平板上生長，從單克隆中 PCR 可擴(kuò)增出真核表達(dá)啟動子 CMV 和目的基因 HGF（圖2），提取質(zhì)粒用 BamH I/Apa I 雙酶切后，在電泳圖上可見一約 2.2 kb 的 DNA 片段（圖3），表明 pcKH 已成功轉(zhuǎn)入減毒沙門菌菌株，命名為TPH。

圖1 BamH I 和 Apa I 酶切質(zhì)粒 pcK-HGF 結(jié)果Figure 1 Electrophoresis diagram of restriction analysis products of pcK-HGF

圖2 以菌液為模板 PCR 擴(kuò)增真核表達(dá)啟動子 CMV 和目的基因 HGFFigure 2 Electrophoresis diagram of PCR products of CMV and HGF genes

圖3 重組菌液質(zhì)粒 pcK-HGF 的 BamH I 和 Apa I 酶切鑒定Figure 3 Electrophoresis diagram of restriction analysis products

2.2 TPH 轉(zhuǎn)染 HUVEC 后 HGF 的表達(dá)及對HUVEC 細(xì)胞的增殖刺激活性 1 × 108cfu TPH 轉(zhuǎn)染 HUVEC 細(xì)胞 48 h 后，用雙抗夾心 ELISA 方法檢測上清中 HGF 的表達(dá)。結(jié)果表明，6 × 105個(gè) HUVEC 細(xì)胞可表達(dá) 160～190 ng 的 HGF 蛋白。采用 MTT 法分析了含不同劑量 HGF 表達(dá)上清對 HUVEC 細(xì)胞的作用，結(jié)果表明，含 HGF 表達(dá)上清有明顯刺激 HUVEC 增殖的活性（P ＜0.05），而且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。加入 800 pg 表達(dá)上清時(shí)刺激活性達(dá)高峰，劑量加大活性不再明顯增加（圖4）。

2.3 細(xì)胞表達(dá)上清對雞胚絨膜尿囊膜血管刺激作用 置入含細(xì)胞表達(dá)上清的甲基纖維素碟后，雞胚絨膜尿囊膜（chicken chorioallantoic membrane，CAM）繼續(xù)孵育 3 d，之后將雞胚絨膜尿囊膜固定后取出，以小碟為中心計(jì)數(shù)小血管數(shù)。結(jié)果對照組在小碟周圍觀察到較弱的生血管效應(yīng)，轉(zhuǎn)染 TP 的HUVEC 細(xì)胞上清組觀察到較明顯的小血管增多現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染 TPH 的 HUVEC 細(xì)胞上清組（HGF 表達(dá)產(chǎn)物 800 pg）以小碟為中心觀察到明顯的毛刷樣小血管形成（圖5），轉(zhuǎn)染 TPH 的 HUVEC 細(xì)胞上清組血管數(shù)量為（133.0 ± 11.5）/cm2，明顯大于轉(zhuǎn)染 TP 的 HUVEC 細(xì)胞上清組（83.3 ± 5.5）/cm2和對照組（62.7 ± 7.1）/cm2（P ＜ 0.05）。

圖4 表達(dá)上清對 HUVEC 的增殖刺激活性（*P ＜ 0.05）Figure 4 HGF expression supernatant induced HUVEC cells proliferation （*P ＜ 0.05）

3 討論

HGF 最初是從血漿和血小板中純化獲得并認(rèn)為是一種刺激肝細(xì)胞增生的有絲分裂原，對肝切除或化學(xué)損傷后的肝再生起重要作用。目前，已知HGF 主要來源于內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞，由前體蛋白（Pro-HGF）經(jīng)剪切、糖基化等翻譯加工合成，由 69 kD 的 α 亞基和34 kD 的 β 亞基組成的異二聚體。HGF 受體為C-met 癌基因編碼的蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)上屬于 11 型酪氨酸激酶受體，具有細(xì)胞外結(jié)合、跨膜和細(xì)胞內(nèi)激酶區(qū)域。

HGF 的作用是通過與其受體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的［10］。HGF 作用于多種類型的細(xì)胞，具有多樣的生物學(xué)作用。它可刺激細(xì)胞增殖，修復(fù)組織器官的損傷，發(fā)揮有絲分裂原的作用，可促進(jìn)胚胎的發(fā)育及各類組織器官的形態(tài)發(fā)生，發(fā)揮形態(tài)發(fā)生原的作用，它還可促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，對某些組織的形成和發(fā)育及腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲具有重要意義。已有許多研究表明 HGF 能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，促進(jìn)損傷局部血管形成［11-12］。血管發(fā)生的研究起初是用于腫瘤血管發(fā)生機(jī)制的探討［13］，之后研究領(lǐng)域漸漸擴(kuò)大，如血管的發(fā)育來源、血管發(fā)生的分子特性及基因調(diào)控、腫瘤的診斷治療、缺血性疾病的治療和創(chuàng)面愈合等［14-19］，也用于篩選治療缺血性疾病、促進(jìn)傷口愈合和抗腫瘤的藥物。顯微水平血管研究實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投嘤檬蠡蛲媒悄ず?CAM，本研究我們選擇了CAM 作為體內(nèi) TPH 促血管形成治療潰瘍愈合潛能的模型，CAM 是雞胚發(fā)育第 4 天由體中胚層和臟壁中胚層融合而成的富含血管的膜，由內(nèi)向外由內(nèi)皮細(xì)胞層、大血管層、毛細(xì)血管篩層 3 層組成，負(fù)責(zé)血?dú)饨粨Q［20］。因 CAM 容易獲得且此模型操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、有效，多用于血管形成效應(yīng)研究［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對照組在小碟周圍觀察到較弱的生血管效應(yīng)，轉(zhuǎn)染 TP 的 HUVEC 細(xì)胞上清組觀察到較明顯的小血管增多現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染 TPH 的HUVEC 細(xì)胞上清組以小碟為中心觀察到明顯的毛刷樣小血管形成，通過定量計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染 TPH 的HUVEC 細(xì)胞上清組血管數(shù)量明顯大于轉(zhuǎn)染 TP的 HUVEC 細(xì)胞上清組和對照組（P ＜ 0.05）。

圖5 HGF 表達(dá)上清對雞胚絨膜尿囊膜血管刺激活性（A：轉(zhuǎn)染 PBS 的正常對照組；B：轉(zhuǎn)染 TPH 的 HUVEC 細(xì)胞組；C：轉(zhuǎn)染 TP 的 HUVEC 細(xì)胞組；*轉(zhuǎn)染 TPH 組與 TP 及 PBS 對照組相比，P ＜ 0.05）Figure 5 Angiogenic activity of HGF expression product on the chick chorioallantoic membrane （A： Normal control group； B：HGF expression supernatant group； C： TP-transfected on CAM group；*TPH group vs TP group and control group， P ＜ 0.05）

在組織損傷再修復(fù)中，上皮和間質(zhì)間存在極為重要的信息交換，HGF 是機(jī)體間質(zhì)和上皮信息交換分子。在胃潰瘍愈合過程中，HGF 和 c-met 受體表達(dá)增加，醋酸型潰瘍主要是由于醋酸直接損傷胃壁組織，引起局部血循環(huán)障礙而造成的［22］，Brozowski 等［23］研究認(rèn)為用 HGF 治療胃潰瘍能通過影響 COX-2 的表達(dá)和胃黏膜血流而加速潰瘍愈合。大鼠胃黏膜 HGF mRNA 分布于再生腺體與黏膜下組織動脈血管之間的基質(zhì)細(xì)胞中，其受體c-met mRNA 則位于再生腺體上皮細(xì)胞，HGF 能使正常大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞環(huán)氧化酶-2 mRNA 和蛋白表達(dá)分別增加至 236% 和 175%。環(huán)氧化酶-2系前列腺素合酶，能促進(jìn)前列腺素的合成，而前列腺素對胃黏膜細(xì)胞具有保護(hù)作用，能增加黏膜的血液循環(huán)，HGF 也可能通過增加前列腺素合成促進(jìn)胃潰瘍的愈合。由此可見，我們構(gòu)建的攜帶 HGF基因的減毒沙門菌 TPH 有潛在治療胃潰瘍的作用，其體內(nèi)防治胃潰瘍的效果有待進(jìn)一步研究。

本研究所選用的減毒沙門菌株 Ty21a 是由Germanier［24］于 1975年將其野型株 Ty2 經(jīng)化學(xué)突變劑亞硝基胍處理而獲得的突變株，是目前用于人群預(yù)防的減毒疫苗株。研究中我們利用減毒沙門菌作為基因傳遞載體的優(yōu)勢，用 Ty21a 作為載體將HGF 基因攜帶至損傷創(chuàng)面局部，使局部轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作為一“微型藥物工廠”持續(xù)一定時(shí)間分泌表達(dá) HGF 活性蛋白而發(fā)揮其多功能生物作用。由于 HGF 蛋白半衰期極短，容易降解，給藥不方便，而且成本高；培養(yǎng)攜帶 HGF 基因的減毒鼠傷寒沙門菌成本低，繁殖快；而編碼外源基因的真核質(zhì)粒遞呈入抗原提呈細(xì)胞，外源基因在其中表達(dá)并持續(xù)釋放，從而達(dá)到基因治療疾病的目的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建攜帶肝細(xì)胞生長因子基因真核表達(dá)載體的減毒沙門菌菌株 TPH，體外觀察 TPH 在 HUVEC 中的表達(dá)情況，然后探討目的基因表達(dá)上清對 HUVEC 的增殖活性，并評價(jià)表達(dá)上清對雞胚絨膜尿囊膜血管生成效應(yīng)的刺激效應(yīng)，目的是評價(jià)攜帶 HGF 基因的減毒沙門菌株TPH 是否在組織創(chuàng)面愈合中通過促進(jìn)血管形成而起促愈合作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，TPH 可能在潰瘍治療中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Methods A stable strain （TPH）， recombinant attenuated Salmonella carrying HGF gene eukaryotic expression vector， was constructed. The TPH was transfected into human umbilical vein endothelial cells （HUVEC）. And the express level of HGF interest protein was assessed by ELISA. Effects of the expression product after TPH transfection on HUVEC proliferation and angiogenesis were assayed by MTT and chicken embryos chorionic allantois membrane （CAM） stimulating activity， respectively.

Results The TPH could be effectively transfected into HUVEC in vitro and highly express HGF interest protein. The expression concentration of HGF protein is （160-190）ng/ml by 6 × 105cells. The expression supernatant after TPH transfection could significantly stimulate the proliferation of HUVEC， with a dose-effect relation， compared with the supernatant （same volume as HGF expression supernatant） from TP-transfected and control groups. The expression of HGF supernatant after TPH transfection also could significantly promote the angiogenesis of chorioallantoic membrane （CAM）. The numbers of blood vessel in expression supernatant from TP-transfected group （83.3 ± 5.5）/cm2and PBS group （62.7 ± 7.1）/cm2were significant fewer than that in HGF expression product from TPH-transfected group （133.0 ± 11.5）/cm2（P ＜ 0.05）.

Conclusion TPH can effectively transfect HUVEC and promote the cell proliferation， stimulate angiogenesis， may play an important role in wound healing in organization， has potential application value in gastric ulcer treatment.

Stimulatory effect of hepatocyte growth factor gene on angiogenesis mediated by attenuated Salmonella

HA Xiao-qin， GUO Xin-yun， GE Xiu-jie， YANG Ying-gui， ZHU Xiao-hong， ZHANG Ping， YANG Shu-juan， XUE Rong-li，ZHANG Yuan-yuan， XIAO Na-na

Objective To investigate the stimulatory effect of TPH， a recombinant attenuated Salmonella strain carrying hepatocyte growth factor （HGF） gene eukaryotic expression vector， on angiogenesis in vitro.

Hepatocyte growth factor；Gene transfer techniques；Angiogenesis inducing agents；Transformation， bacterial；Salmonella typhimurium

HA Xiao-qin， Email： haxiaoqin2013@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2015.06.011

國家自然科學(xué)基金（81273568）；甘肅省杰出青年基金（2011GS03841）；解放軍總后勤部后勤科研項(xiàng)目（CLZ11J09）

730050 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院檢驗(yàn)中心/甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

哈小琴，Email：haxiaoqin2013@163.com

2015-08-06

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2015, 10(6):522-527

Author Affiliation： Department of Clinical Laboratory Medicine， Key Laboratory of Stem Cell and Gene Drug in Gansu Province，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region， Lanzhou 730050， China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2015, 10(6):522-527