60Coγ射線輻照劑量對牛血清白蛋白結(jié)構(gòu)的影響

耿勝榮 李新 李查德 鉏曉艷 廖濤 夏和舟 葉麗秀 程薇

摘要：為研究60Coγ射線輻照劑量對牛血清蛋白結(jié)構(gòu)的影響，以單一組分牛血清白蛋白（BSA）為模型，研究BSA水溶液輻照0～50 kGy劑量后的含量、結(jié)構(gòu)和微觀形態(tài)變化。結(jié)果表明，BSA主要由25～214 kDa約10種分子量的蛋白質(zhì)組成，其中55 kDa的蛋白質(zhì)含量最大，各組分含量隨輻照劑量的增加而下降，輻照50 kGy時幾乎全部降解；BSA在210、280 nm處各有1個紫外吸收峰，峰高均隨著劑量的增加而下降，輻照30 kGy時280 nm處的峰消失；BSA二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲含量分別為40.8%、37.3%和21.9%，α-螺旋含量隨輻照劑量增加而下降，其他結(jié)構(gòu)含量呈上升趨勢；輻照前后BSA的酰胺Ⅰ帶紅外吸收峰從1 650.8 cm-1紅移至1 655.5 cm-1處；BSA輻照后微觀表面由平滑變?yōu)轳薨?，形成松散的片狀。輻照后牛血清白蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，輻照劑量越大，反應(yīng)程度越大。

關(guān)鍵詞：60Coγ射線；牛血清白蛋白；劑量；結(jié)構(gòu)改變

中圖分類號：TS201.6；TL99 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5378-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.045

Effect of 60Coγ Rays Irradiation Dose on Bovine Serum Albumin Structure

GENG Sheng-rong1，LI Xin1，LI Cha-de2，ZU Xiao-yan1，LIAO Tao1，XIA He-zhou1，YIE Li-xiu1，CHENG Wei1

（1.Institute for Farm Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Innovation Center of Agricultural Science and Technology，Wuhan 430064，China；2.School of Chemistry ，Chemical Engineering and Life Sciences， Wuhan University of Technology， Wuhan 430070，China）

Abstract：To study the influence of 60Co γ ray irradiation dose on bovine serum component，as a single component model，BSA solution was irradiated by 0～50 kGy respectively and the protein content，secondary structure molecular and morphology were determined. The results showed that the BSA was mainly composed of 10 proteins and the molecular weights were 25～214 kDa，of which the protein content of 55 kDa was the largest one. The protein content was decreased with the increasing of irradiation dose and the content of 10 proteins were degraded after irradiated 50 kGy. The UV-Vis（UV-Visible Spectrophotometer） of BSA appeared two absorption peaks at 210 nm and 280 nm，respectively. The height of two peaks were decreased with the dose increasing and 1 280 nm-peak disappeared after the BSA was irradiated by 30 kGy. The secondary structure content of α-helix，β-fold & β-corner and random coil from BSA were 40.8%，37.3% and 21.9%. The α-helix content decreased with the dose increasing and the other structural content increased with the dose increading. Amide I band of infrared absorption peak of bovine serum albumin shifted from 1 650.8 cm-1 to 1 655.5 cm-1. The BSA had a smooth surface microstructure before irradiation and changed into a loose sheet after irradiaton. Thus，the main effect region of the radical irradiation was α-helix of BSA，subsequently led the increasing of β-fold，β-turn and random coil increases，finally the protein turned from the ordered state into a disordered state，the greater the dose，the greater the degree of reaction.

Key words：60Coγ rays；bovine serum albumin；dose；structure change

牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)的最重要的組分，它具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞分化等生物學(xué)功能，與現(xiàn)代生物技術(shù)包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程的發(fā)展有密切關(guān)系[1]。由于原料來源和生產(chǎn)環(huán)節(jié)引入的外源病毒會影響牛血清的品質(zhì)以及下游生物制品的品質(zhì)[2]，關(guān)于60Coγ射線滅活病原菌和破壞細(xì)胞的效果早期有大量研究[3，4]，但對于牛血清中蛋白組分的生理指標(biāo)變化未曾涉及，牛血清生物功能的破壞，根本原因在于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的改變，研究輻照對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響有利于建立高效的輻照工藝。

牛血清中的蛋白質(zhì)可分為纖維蛋白原、白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白和γ-球蛋白等多種成分[5]，其中BSA是生物體血漿中含量最豐富的一種載體蛋白質(zhì)，約占血漿中總蛋白質(zhì)的52%～62%，因其能夠與多種小分子化合物進(jìn)行可逆的結(jié)合而起到體內(nèi)轉(zhuǎn)運作用，是常用的蛋白質(zhì)模型。BSA是由607個氨基酸殘基組成的一種球蛋白，含有17個二硫鍵，一個自由半胱氨酸基團(tuán)，為較大的螺旋形結(jié)構(gòu)。本試驗利用紫外光譜（UV-Vis）、紅外光譜（FT-IR spectrometer， FT-IR）、圓二色譜（Circular dichroism，CD）和掃描電鏡（Scanning electron microscope，SEM），研究輻照后BSA結(jié)構(gòu)的變化，為建立劑量與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

BSA，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白標(biāo)樣（MBP-β-半乳糖苷酶，分子量175 kDa；MBP-截短型-β-半乳糖苷酶，分子量80 kDa；MBP-CBD，分子量58 kDa；CBD-Mxe intein-2CBD，分子量46 kDa；CBD- Mxe intein，分子量30 kDa），Thermo公司。

γ射線輻照源（60Co源，裝源量25.5萬居里），湖北省輻照實驗中心；掃描電鏡（Quanta 200型），荷蘭FEI公司；示差掃描量熱儀（DSC200F3型），德國Netzsch公司；紅外光譜儀（NICOLET 5700型，紅外顯微鏡），美國熱電公司；紫外可見分光光度計（T6新世紀(jì)），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1515型高效液相色譜泵、2690D型分離模塊、2410型折射率檢測器、Waters ultrahy drogel 2000型和Waters ultrahy drogel 250型色譜柱，美國Waters公司；圓二色譜（J-810型），日本分光公司（JASCO）。

1.2 試驗設(shè)計

BSA的100 mg/mL水溶液采用有氧包裝后，在常溫下（約25 ℃）分別輻照0、10、20、30、40、50 kGy劑量，另外一個處理在低溫下（約10 ℃）輻照10 kGy劑量。輻照方式采用動態(tài)照射法，平均劑量率約為30 Gy/min。硫酸亞鐵劑量計跟蹤劑量，照完后樣品采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）方法分析蛋白含量和組分變化；采用UV-Vis、CD、FT-IR、SEM表征結(jié)構(gòu)變化，其中CD測定直接取樣稀釋，其他指標(biāo)測定取輻照后BSA的凍干樣。

1.3 檢測方法

SDS-PAGE：樣品濃度1 mg/mL，微孔濾膜過濾，上樣量10 μL。分離膠濃度9%，分離膠段電泳電壓100 V，濃縮膠濃度4%，濃縮膠段電泳電壓60 V，電泳時間2.5 h。

UV-Vis：樣品濃度5 mg/mL，蒸餾水溶劑，微孔濾膜過濾，波長掃描范圍190～410 nm。

CD：將濃度為0.5 mg/mL的樣品注入1.0 cm的石英比色皿中，以去離子水為對照?？刂瞥绦驗镾pectra manager，氣體流量為4～5 L/min，檢測波長范圍190～260 nm，1次數(shù)據(jù)采集，采集頻率200 nm/min。二級結(jié)構(gòu)含量根據(jù)儀器自帶程序楊氏公式給出。

FT-IR：取凍干樣品與KBr混合壓片，掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1。

SEM：取凍干樣品少量黏在金屬臺上，噴金，電鏡掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSA輻照后蛋白組分及分子量的變化

BSA溶液分別輻照0～50 kGy后作SDS-PAGE分析，見圖1。未輻照BSA有10條帶，1～3條分子量大于175 kDa，第4～5條在175～80 kDa范圍，第6條在58 kDa處，濃度相當(dāng)大，第7～9條在46～30 kDa之間，第10條小于46 kDa。低溫輻照10 kGy BSA與常溫10 kGy相比條帶顏色略深，尤其是在58 kDa處。從20 kGy開始，大于58 kDa的蛋白條帶消失，形成均勻的連續(xù)分子量的混合物。58 kDa處蛋白條帶也逐漸變淺。

根據(jù)遷移距離和標(biāo)樣蛋白質(zhì)的分子量計算，各劑量對應(yīng)的條帶分子量見表1。未輻照BSA主要由214、204、189、172、135、55、38、34、29、25 kDa這10種分子量蛋白質(zhì)組成，其中55 kDa分子量蛋白含量最大。經(jīng)10～50 kGy劑量輻照后，各分子量蛋白逐漸降解消失，形成混合物。

2.2 BSA輻照后UV-Vis光譜吸收變化

BSA溶液分別輻照0～50 kGy后的UV-Vis圖如圖2所示，未輻照BSA水溶解部分的紫外吸收光譜在210 nm處和280 nm處各有1個峰，吸光度分別為2.74和0.318 L/g·cm，隨著劑量的增加峰高逐漸下降，劑量大于30 kGy時，280 nm處的峰消失（圖2）。280 nm的吸收峰是分子中的2個色氨酸和19個酪氨酸的芳雜環(huán)的Π-Π*和n-Π*躍遷引起的，而210 nm處的吸收峰是由肽鍵上的C=O的n=Π*躍遷引起的，與BSA的α-螺旋含量有關(guān)[6]。輻照引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，主要為肽鍵上的C=O的n=Π*躍遷能量減小和α-螺旋含量減少，且與劑量呈正相關(guān)，大于20 kGy輻照后樣品的210 nm和280 nm兩個紫外吸收峰高下降尤其明顯。

2.3 BSA輻照后CD變化

肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基以及二硫鍵是主要的光活性生色基團(tuán)，生色基團(tuán)對左右圓偏振光吸收不同，造成偏振矢量的振幅差，從而得到蛋白質(zhì)和多肽分子的二級結(jié)構(gòu)，圓二色譜儀是研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的有效手段。BSA溶液顯示（圖3）出α-螺旋結(jié)構(gòu)的3個特征峰，192 nm處1個正峰，208、222 nm處2個負(fù)峰，吸收強(qiáng)度反映蛋白α-螺旋的含量[7]。

BSA溶液分別經(jīng)0～50 kGy輻照后，測定樣品的CD光譜（圖3）。隨著輻照劑量的增加，192、208和222 nm處的3個峰值均下降，劑量大于30 kGy時，在192 nm處的峰型發(fā)生變化。用楊氏法計算得到BSA二級結(jié)構(gòu)中4種結(jié)構(gòu)的含量，詳見表2。隨著輻照劑量的增加，α-螺旋含量從40.8%（0 kGy）下降至10.0%（50 kGy），β-折疊和β轉(zhuǎn)角的總含量從37.3%增加至51.3%，無規(guī)卷曲從21.9%增加至38.7%。

2.4 BSA輻照后FT-IR變化

牛血清酰胺Ⅰ帶主要是氨基酸殘基的C=O伸縮振動吸收，是α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等不同結(jié)構(gòu)振動峰的加合帶，各吸收峰范圍在1 600～1 685 cm-1之間，其中1 600～1 640 cm-1歸屬β-折疊，1 640～1 650 cm-1歸屬無規(guī)卷曲，1 650～1 670 cm-1歸屬α-螺旋，1 680～1 685 cm-1歸屬轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 651 cm-1歸屬α-螺旋[8]。酰胺Ⅱ帶吸收峰范圍1 500～1 600 cm-1，包含C-N的伸縮振動和N-H的變形振動[9]。

未輻照和50 kGy輻照BSA溶液紅外吸收圖譜見圖4。未輻照BSA的酰胺Ⅰ帶的紅外最大吸收位于1 650.8 cm-1附近，表明BSA以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。輻照BSA吸收峰紅移至1 655.5 cm-1處，輻照BSA樣品酰胺Ⅱ帶移至1 536.6 cm-1附近，與未輻照相比，峰高變高并尖銳。紅外吸收變化說明輻照使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化。

2.5 BSA輻照后SEM結(jié)構(gòu)變化

圖5為BSA水溶液或凝膠經(jīng)凍干后的SEM圖。由圖5可知，未輻照BSA表面光滑，經(jīng)30 kGy輻照后表面有小量褶皺和小突起，40、50 kGy輻照處理后表面褶皺增加，小突起變?yōu)榇笃瑺钔黄稹１狙芯拷Y(jié)果與耿勝榮等[10]明膠溶液輻照后因交聯(lián)反應(yīng)微觀表面變得粗糙相似。

3 討論

在0～50 kGy輻照范圍內(nèi)，隨著輻射劑量的增加，牛血清白蛋白的主要蛋白組分含量逐漸減少，當(dāng)大于20 kGy輻照后，僅有4種主要蛋白組分（135、55、34、29 kDa）存在，輻照后BSA蛋白質(zhì)溶解性變差，微觀表面呈現(xiàn)松散的片狀結(jié)構(gòu)，這與明膠水溶液輻照的特性相似[11]，明膠水溶液輻照后蛋白質(zhì)組分電泳后發(fā)生降解反應(yīng)，蛋白質(zhì)含量下降，微觀表面形成更為緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

本試驗中，α-螺旋含量下降，而β-折疊和β轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲含量升高，α-螺旋含量在輻照劑量0～10 kGy間下降幅度最大，20 kGy后變緩和，這說明輻照自由基主要作用BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域。熊澤云等[12]報道的鑭（Ⅲ）-蕓香甙配合物與人血清白蛋白反應(yīng)后α-螺旋含量下降，其他結(jié)構(gòu)含量升高，認(rèn)為二者結(jié)合導(dǎo)致人血清白蛋白的構(gòu)象變化。吳錦繡等[13]報道殼聚糖與牛血清蛋白相互作用導(dǎo)致的208和222 nm圓二色譜峰向低波數(shù)移動，以及振幅下降，說明BSA發(fā)生降解，從而引起組成和結(jié)構(gòu)的變化。

本試驗結(jié)果表明，大于30 kGy輻照的BSA溶液在210、280 nm處的紫外光譜吸收峰大幅度下降。薛春霞等[6]認(rèn)為，抗生素頭孢地尼結(jié)構(gòu)中的羧基解離后，離子誘導(dǎo)BSA肽鏈伸展，內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基芳雜環(huán)疏水基團(tuán)裸露，使278 nm處吸收增強(qiáng)；羅紅霉素分子中的羥基與BSA肽鏈中的氨基酸殘基中的含氧或含氮基團(tuán)形成氫鍵，從而使氨基酸殘基中含氧或含氮基團(tuán)原有的鍵強(qiáng)減弱，278 nm處吸收峰下降。本試驗中輻射引起的BSA紫外減色效應(yīng)，與羅紅霉素的作用效果相同，但結(jié)合圓二色譜和掃描電鏡結(jié)論分析，輻照后的BSA紫外吸收下降，與BSA的疏水基團(tuán)增加，導(dǎo)致溶解性下降，發(fā)色基團(tuán)含量減少有關(guān)，并不是形成了氫鍵。

50 kGy輻照的BSA酰胺Ⅰ帶發(fā)生紅移，酰胺Ⅱ帶峰型變尖銳，說明α-螺旋含量、C-N、N-H鍵合力發(fā)生改變。這與安秀林等[8]的研究報道相同，也與本試驗中圓二色譜變化一致。

4 小結(jié)

1）未輻照牛血清白蛋白有10種主要蛋白組分，分子量分別為25、29、34、38、55、135、172、189、204、214 kDa，其中55 kDa含量最多。常溫高于20 kGy的牛血清輻照滅菌劑量明顯造成蛋白的分子量降解，低溫有一定的抑制作用。

2）輻照后BSA紫外吸收峰型和圓二色譜峰型均隨著輻照劑量的增加而下降；隨著輻照劑量增加，BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降，同時β-折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的含量增加。

3）輻照引起B(yǎng)SA微觀表面由光滑漸變?yōu)槠瑺钔黄穑椪找養(yǎng)SA變性，導(dǎo)致蛋白溶解性變差。

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