馬春虎,許 倩,沈榮飛,肖鑠洋,李冰清,任 祎(.承德醫(yī)學院,河北承德 067000;.承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院0級臨本0班)
TRIM28對肺鱗癌SK-MES-1細胞生長的影響*
馬春虎1,許 倩1,沈榮飛2,肖鑠洋2,李冰清2,任 祎2
(1.承德醫(yī)學院,河北承德 067000;2.承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院2012級臨本10班)
目的:探討TRIM28基因?qū)Ψ西[癌細胞系SK-MES-1細胞生長的影響。方法:采用RNA干擾技術(shù)抑制肺鱗癌SK-MES-1細胞TRIM28基因的表達,通過RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測抑制效果,應(yīng)用克隆形成實驗和MTT實驗觀察TRIM28基因被抑制后SK-MES-1細胞的增殖和活性。結(jié)果:RNA干擾技術(shù)能有效抑制TRIM28基因在肺鱗癌SK-MES-1細胞中的表達。TRIM28基因被抑制后,肺鱗癌SK-MES-1細胞的活性和生長受了到明顯抑制。結(jié)論:TRIM28對肺鱗癌SK-MES-1細胞的生長具有促進作用。
肺鱗癌;TRIM28;RNA干擾
肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤,其中80%以上為非小細胞肺癌,鱗狀細胞癌是其中最主要的類型[1]。肺癌5年存活率僅為15%,大部分患者確診時已到晚期[2]。因此,尋找新的治療靶點迫在眉睫。最新研究發(fā)現(xiàn),TRIM28是腫瘤發(fā)生中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[3]。作為一種核共抑制因子,TRIM28與細胞DNA損傷后染色質(zhì)介導的轉(zhuǎn)錄抑制和DNA修復有關(guān)。TRIM28能通過抑制p53的活性從而增強細胞對DNA損傷的敏感性并抑制細胞凋亡;另外,當TRIM28異常表達時,可抑制E2F1的轉(zhuǎn)錄及促凋亡功能。但有關(guān)TRIM28基因在肺癌中生物學作用的報道較少。本研究采用RNA干擾技術(shù)觀察了TRIM28基因?qū)Ψ西[癌SK-MES-1細胞生長的影響,初步探討TRIM28在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
1.1 材料 人肺鱗癌細胞系SK-MES-1為承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清,美國GIBICO公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000,美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Taq酶,日本TaKaRa公司;兔抗人TRIM28多克隆抗體,美國Proteintech公司。
1.2 細胞培養(yǎng) SK-MES-1細胞采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)靜置培養(yǎng)。當細胞生長狀態(tài)良好并且融合度達到80%左右時,用2.5g/L的胰蛋白酶消化進行細胞傳代。
1.3 siRNA轉(zhuǎn)染SK-MES-1細胞 TRIM28-siRNA:5'-GATGA TCCCTACTCAAGTGTT-3',對照siRNA(scrambled):5'-GTTC TCCGAACGTGTCACGT-3’(上海吉瑪生物試劑公司)。
SK-MES-1細胞至對數(shù)生長期后以2×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板,隨機分為實驗組和對照組,采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染TRIM28-siRNA和對照siRNA,終濃度為40nM,每組設(shè)3個復孔。轉(zhuǎn)染6h后更換成DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。
1.4 轉(zhuǎn)染后SK-MES-1細胞TRIM28 mRNA和蛋白表達的檢測 轉(zhuǎn)染48h時收集細胞,分別檢測SK-MES-1細胞TRIM28 mRNA和蛋白的表達。
1.4.1 RT-PCR法檢測TRIM28 mRNA:提取SK-MES-1細胞的總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系為:2.5μl cDNA模板,20μmol/L引物(TRIM28上游引物:5'-ATGTGAGCGTGTACTGCTGG-3’、下游引物:5'-ACGTCTGCCTTGTCCTCAGT-3'),0.2mM dNTP,50mM Tris-HCl(pH 8.3),10mM KCl,5mM (NH4)2SO4,2mM MgCl2,0.75U Taq酶,總體積為25μl。反應(yīng)條件:95℃變性20s,62℃退火20s,72℃延伸30s,30個循環(huán)后,72℃延伸7min。
1.4.2 Western-blot法檢測TRIM28蛋白:收集SK-MES-1細胞蛋白,常規(guī)BCA方法進行定量。制備15%聚丙烯酰胺凝膠,進行SDS-PAGE電泳(2-3h),轉(zhuǎn)移到PVDF膜(50min),室溫5% BSA封閉1h,稀釋兔抗人TRIM28多克隆抗體(稀釋度1:1000)4℃孵育過夜,ECL發(fā)光液顯色曝光。
1.5 平板克隆形成實驗 TRIM28-siRNA轉(zhuǎn)染細胞24h后,胰酶消化細胞,以200個/孔接種于6孔板,加DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)2ml/孔繼續(xù)培養(yǎng)10d,常規(guī)固定染色,顯微鏡下計數(shù)集落,以≥50個細胞作為一個集落,并計算克隆形成率,克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。
1.6 MTT法 胰酶消化對數(shù)生長期細胞,以1×104/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染TRIM28-siRNA,終體積為100μl/孔,每組設(shè)4個復孔;6h后每孔加入含20%小牛血清、無抗生素的DMEM細胞培養(yǎng)液,100μl/孔,孵育48h后,棄去培養(yǎng)液,加入MTT溶液(20μl/孔)培養(yǎng)4h,吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后加入DMSO液(150μl/孔),采用酶標儀于550nm處檢測吸光度值。
1.7 統(tǒng)計分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計處理,兩組間計量資料的比較行t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 siRNA干擾后SK-MES-1細胞TRIM28 mRNA和蛋白的表達 與對照siRNA[mRNA(0.91±0.09)、蛋白(0.90± 0.06)]比較,TRIM28-siRNA能明顯抑制肺鱗癌SKMES-1細胞TRIM28 mRNA(0.19±0.08)和蛋白(0.28± 0.09)的表達水平(P<0.05)。見圖1-2。
圖1 肺鱗癌SK-MES-1細胞TRIM28 mRNA的表達(1.對照siRNA,2.TRIM28 siRNA)
2.2 siRNA干擾后SK-MES-1細胞克隆形成數(shù) TRIM28-siRNA組細胞克隆形成數(shù)顯著低于對照組克隆形成數(shù),組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,附表、圖3)。說明TRIM28 siRNA干擾可明顯抑制SK-MES-1細胞增殖。
圖2 肺鱗癌SK-MES-1細胞TRIM28蛋白的表達(1.對照siRNA,2.TRIM28-siRNA)
圖3 肺鱗癌SK-MES-1細胞克隆形成數(shù)(1.對照siRNA,2.TRIM28-siRNA)
2.3 siRNA干擾后SK-MES-1細胞的活性 轉(zhuǎn)染48h,實驗組SK-MES-1細胞的活性明顯低于對照組(P<0.05)。見附表:
附表 TRIM28 siRNA干擾對SK-MES-1細胞增殖和活性的影響(±s,n=4)
附表 TRIM28 siRNA干擾對SK-MES-1細胞增殖和活性的影響(±s,n=4)
組別 SK-MES-1細胞克隆形成數(shù) SK-MES-1細胞活性實驗組 299±12 0.88±0.22對照組 725±24 2.29±0.08 P <0.05 <0.05
TRIM蛋白是RING型E3泛素配體亞家族成員,在人類和小鼠中有70多種,廣泛參與各種生物進程,包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞生長、凋亡、發(fā)育和腫瘤形成等。多種TRIM蛋白能夠參與核受體的調(diào)節(jié)過程,如TRIM19定位于細胞核PML核體中,調(diào)節(jié)多種反應(yīng)過程,如細胞應(yīng)激、DNA修復和病毒感染等[4];TRIM24調(diào)節(jié)維甲酸受體α、甲狀腺受體等核受體,并能增強維甲酸受體α介導的轉(zhuǎn)錄[5];TRIM13過表達能引起p53表達增強,進而促進凋亡;TRIM29通過與TIP60相互作用調(diào)節(jié)p53蛋白,過表達預(yù)示胃癌的臨床預(yù)后較差[6]。另有研究發(fā)現(xiàn),其它的TRIM蛋白,如TRIM32、TRIM8和TRIM40,與特異性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。
TRIM28(又名KAP1),由Friedman在1996年最早鑒定,是核磷脂酰肌醇-3激酶(PIKK)家族的新成員,是必需的表觀遺傳穩(wěn)定基因[7]。TRIM28在DNA損傷后迅速被PIKK其它家族成員磷酸化,磷酸化的TRIM28快速定位于核內(nèi)DNA鏈上,說明其與細胞DNA損傷后染色質(zhì)介導的轉(zhuǎn)錄抑制和DNA修復具有重要的關(guān)聯(lián)。已經(jīng)證實,TRIM28可通過α螺旋區(qū)與MDM2的中心酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合并協(xié)同作用,使p53去乙酰化和抑制P53活性[8]。研究中可通過RNA干擾抑制非小細胞肺癌內(nèi)源性TRIM28的表達,進而增強p53的轉(zhuǎn)錄活性,從而促進細胞凋亡。另外,Chen等發(fā)現(xiàn)[9],TRIM28能夠促進E2F1-HDAC1復合物的形成并抑制E2F1乙?;敭惓1磉_TRIM28時,具有抑制E2F1的轉(zhuǎn)錄及促凋亡功能。以上研究均提示,TRIM28可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。
本研究設(shè)計了針對TRIM28基因的siRNA序列,并轉(zhuǎn)染到肺鱗癌細胞系SK-MES-1細胞中,證實該siRNA能夠較好地抑制TRIM28的表達。同時研究發(fā)現(xiàn),有效抑制肺鱗癌SK-MES-1細胞的TRIM28基因后,SK-MES-1細胞的增殖和活性受到了明顯抑制。因此提示,作為通用的核抑制物,TRIM28對非小細胞肺癌細胞生長具有明顯促進作用,可能在非小細胞肺癌進展中發(fā)揮重要作用。但關(guān)于TRIM28基因促進非小細胞肺癌生長的作用機制還有待深入研究。
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INFLUENCES OF TRIM28 ON GROWTH OF LUNG SQUAMOUS CELL CARCINOMA SK-MES-1 CELLS
MA Chunhu, XU Qian, SHEN Rong-fei, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)
Objective:To study the influences of TRIM28 gene on growth of lung squamous cell carcinoma SKMES-1 cells.Methods:TRIM28 gene was inhibited by RNA interference assay, RT-PCR and Western-blot was used to detect the inhibitory effects. After the TRIM28 gene was inhibited, the proliferation and activity of SK-MES-1 cells were detected respectively by clone formation assay and MTT cell proliferation assay.Results:Expression of TRIM28 in SK-MES-1 cells was inhibited significantly by RNA interference. The activity and growth of SK-MES-1 cells decreased obviously after the TRIM28 gene was inhibited.Conclusions:TRIM28 can promote the growth of lung squamous cell carcinoma SK-MES-1 cells.
Lung squamous cell carcinoma; TRIM28; RNA interference
R734.2
A
1004-6879(2015)01-0005-04
2014-06-03)
* 河北省自然科學基金項目(C2010001353),河北省教育廳資助項目(QN20131010)