呼吸道分離鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力與耐藥性關(guān)系的研究

劉 原，柯 蕊，楊 妮，趙玉杰，2，和 平，馮雁京，張立然，耿 燕

（1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科；3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 西安710004）

隨著抗生素的廣泛使用，鮑曼不動(dòng)桿菌的感染率逐年上升，其中80%的患者感染途徑為呼吸道，科室分布也以呼吸內(nèi)科為主，在患者機(jī)體免疫功能受損或抵抗力下降時(shí)引起肺部感染或合并肺部感染最為常見[1]。加強(qiáng)對呼吸系統(tǒng)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制研究非常必要。既往研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛以生物被膜（Biofilm，BF）的形式存在[2]，但有關(guān)呼吸道分離的鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力與細(xì)菌耐藥性之間的關(guān)系尚無相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討呼吸道分離鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力與耐藥性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2014年3月至2014年12月西安市具有代表性的六所三級(jí)甲等綜合醫(yī)院臨床痰標(biāo)本中分離鑒定的非重復(fù)鮑曼不動(dòng)桿菌178株。大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853為藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株，鮑曼不動(dòng)桿菌A601為生物被膜陽性對照株。

1.1.2 主要儀器 Vitek－2細(xì)菌全自動(dòng)鑒定儀（法國梅里埃生物公司），96孔板酶標(biāo)儀（德國BMG Lab Technologies公司）。

1.1.3 主要試劑 MH 瓊脂粉，LB培養(yǎng)基，0.25%（v／v）結(jié)晶紫染液，分析純無水乙醇。藥敏紙片均購自英國Oxoid公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用K－B法測定14種抗生素的敏感性。用精度為1mm的游標(biāo)卡尺測量并記錄藥敏平板的抑菌圈直徑。結(jié)果按照（Clinical and Laboratory Standards Instltute，CLSI）2013年版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作和結(jié)果判斷。

1.2.2 生物被膜形成時(shí)間測定 依據(jù)參考文獻(xiàn)方法[3]略作改進(jìn)：隨機(jī)挑選18株臨床菌株和生物被膜陽性株，制備濃度為1×109CFU／ml的過夜菌液，取20ml接種于聚乙烯96孔板（每孔含200ml LB培養(yǎng)基），每株菌做6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)陰性對照，37℃靜置培養(yǎng)，24小時(shí)換液，連續(xù)7天用酶標(biāo)儀測定。測定前用無菌蒸餾輕洗3次，除去浮游菌，自然風(fēng)干后加入0.25g／L結(jié)晶紫染液200ml，室溫染色20 min，用蒸餾水洗去染液，自然風(fēng)干后用95%乙醇萃取10min。用酶標(biāo)儀測定其在590nm處的吸光度（OD）值，計(jì)算6個(gè)復(fù)孔的平均值，繪制生長曲線。重復(fù)測定3次。

1.2.3 生物被膜形成能力測定 按照上述方法，對收集的178株鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力進(jìn)行測定，每株菌做3個(gè)復(fù)孔，設(shè)陰性和陽性對照，24小時(shí)換液，于第5天測定其在590nm處的吸光度（OD）值，重復(fù)測定3次。結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[4]：空白對照OD值的均值±標(biāo)準(zhǔn)差定義為ODc，待測菌株的OD值與ODc比較，OD≤2＊ODc為生物被膜形成陰性株；OD＞2＊ODc為生物被膜形成陽性株，其中，2＊ODc＜OD≤4＊ODc為生物被膜形成能力弱菌株，OD＞4＊ODc為生物被膜形成能力強(qiáng)菌株。

2 結(jié)果

2.1 藥敏結(jié)果

178株臨床分離株體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果見表1。其中對頭孢類二代、三代、四代耐藥率均較高，均大于65%；單酰胺類氨曲南、喹諾酮類、磺胺等均有較高的耐藥率；氨基糖甙類阿米卡星的耐藥率較低；對加入酶抑制劑的頭孢菌素類的耐藥率亦低，對碳青霉烯類的耐藥率最低。

2.2 生物被膜形成時(shí)間測定結(jié)果

對19株鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成時(shí)間動(dòng)態(tài)監(jiān)測：按照生物被膜形成趨勢分為三組，見圖1，生物被膜形成能力較強(qiáng)的3株（包括生物被膜陽性對照株），形成能力較弱的有8株，無生物被膜形成能力的有8株。在培養(yǎng)48h內(nèi)生物被膜生長緩慢，第3天時(shí)生物被膜形成速度最快，到第4、5天時(shí)生長速度減緩逐漸達(dá)到平臺(tái)期，第6、7天時(shí)呈負(fù)增長趨勢或漲幅速度變慢。選擇生物被膜生長成熟的第5天為檢測點(diǎn)。

2.3 生物被膜形成能力測定結(jié)果

對培養(yǎng)至第5天的178株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行生物被膜形成能力的半定量測定：46.07%（82株）生物被膜形成陰性；53.93%（96株）生物被膜形成陽性，其中11.80%（21株）生物被膜形成能力強(qiáng)，42.13%（75株）生物被膜形成能力弱。

圖1 鮑曼不動(dòng)桿菌在590nm處的吸光度值（OD值）

2.4 生物被膜形成能力與耐藥性之間的相關(guān)性分析

比較鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜陽性株與生物被膜陰性株對常用抗菌藥物的耐藥率發(fā)現(xiàn)，除亞胺培南、美羅培南、頭孢呋辛、頭孢曲松、氨曲南外，生物被膜形成陰性株對其余九種抗生素的耐藥率高于生物被膜陽性株。鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力與耐藥性密切相關(guān)。見表1。

3 討論

細(xì)菌形成生物被膜后，由于生物被膜的物理屏障作用和膜內(nèi)的特殊微環(huán)境，使其耐藥性顯著提高[5]。然而，細(xì)菌生物被膜的形成能力受環(huán)境及自身遺傳特質(zhì)的影響，調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，目前關(guān)于細(xì)菌生物被膜形成能力與耐藥性的關(guān)系尚無定論。Rao[6]發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜陽性株對頭孢肟、氨曲南、阿米卡星、環(huán)丙沙星的耐藥率高于生物被膜陰性株；Rodriguez－Bano等[7]發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成陽性株對亞胺培南及環(huán)丙沙星的耐藥率低于生物被膜形成陰性菌株。然而Wroblewska等[8]研究提示鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力與其對碳青霉烯類抗生素的耐藥性無相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)對于耐藥率普遍較低的藥物（如亞胺培南和美羅培南）及耐藥率普遍較高的藥物（如頭孢呋辛、氨曲南），鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力與耐藥性之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對其余九種抗生素生物被膜形成陰性株的耐藥率高于生物被膜形成陽性株。與 Rodriguez－Bano[4]的研究部分一致，但與Rao[3]的報(bào)道相反，可能原因有：1）對于某些臨床常用的或傳統(tǒng)抗生素，幾乎所有的鮑曼不動(dòng)桿菌都對其耐藥，如：頭孢呋辛、頭孢曲松。同樣，對于某些使用頻率較低或新型抗生素，大多數(shù)鮑曼不動(dòng)桿菌都對其敏感，如亞胺培南、美羅培南。由于抗生素的使用習(xí)慣和頻率的差異所造成的抗生素選擇壓力可能導(dǎo)致這一結(jié)果的出現(xiàn)；2）細(xì)菌在形成生物被膜后耐藥性提高，但就細(xì)菌個(gè)體而言，由于生物被膜的屏障作用使生物被膜微環(huán)境中抗生素的濃度較低，而且由于生物被膜內(nèi)細(xì)菌的緊密結(jié)合使抗生素的結(jié)合位點(diǎn)減少，生物被膜形成陽性菌株面對的抗生素壓力較生物被膜形成陰性菌相對小，其個(gè)體適應(yīng)能力或許低于浮游狀態(tài)的菌株。相反，生物被膜陰性菌株多以浮游菌狀態(tài)存在，在抗生素的選擇壓力下，其耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移及耐藥基因突變的積累可能較生物被膜形成陽性株更為活躍，使細(xì)菌個(gè)體獲得較高的耐藥性[9]。

表1 生物被膜形成能力不同的鮑曼不動(dòng)桿菌對14種抗菌藥物耐藥性的比較

本研究還發(fā)現(xiàn)形成能力不同的菌株其動(dòng)態(tài)生長曲線也不盡相同，但均能體現(xiàn)生物被膜形成的不同階段。在培養(yǎng)48小時(shí)內(nèi)生長曲線較平坦，對應(yīng)為定植與不可逆結(jié)合階段。培養(yǎng)至第3天時(shí)生長曲線漲幅速度最快，與生物被膜成熟前期相對應(yīng)。生物被膜成熟期表現(xiàn)為到培養(yǎng)的第4、5天時(shí)生物被膜生長速度減緩。培養(yǎng)至第6、7天時(shí)生長曲線漲幅速度變慢或呈負(fù)增長趨勢，對應(yīng)于生物被膜成熟后期。在對鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力的測定發(fā)現(xiàn)，53.93%的菌株生物被膜形成陽性，低于Rao[6]和王政[3]等的報(bào)道。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能與實(shí)驗(yàn)室條件、操作以及細(xì)菌自身遺傳因素的影響有關(guān)。

綜上，呼吸道鮑曼不動(dòng)桿菌多可形成生物被膜，提示生物被膜是呼吸道分離鮑曼不動(dòng)桿菌提高其環(huán)境適應(yīng)能力的方式之一。呼吸道分離的鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成能力與耐藥性呈負(fù)相關(guān)，可能與生物被膜產(chǎn)生的耐藥屏障作用以及菌株個(gè)體耐藥性的提高有關(guān)，但具體相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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