132-N-（2-羥乙基）-153-N-（2-羥乙基）-173-甲氧羰基二氫卟吩e6-131-152-二酰胺的合成工藝及光學性質(zhì)研究*

朱國華，金英學

（哈爾濱師范大學化學化工學院，黑龍江哈爾濱150025）

科研與開發(fā)

132-N-（2-羥乙基）-153-N-（2-羥乙基）-173-甲氧羰基二氫卟吩e6-131-152-二酰胺的合成工藝及光學性質(zhì)研究*

朱國華，金英學*

（哈爾濱師范大學化學化工學院，黑龍江哈爾濱150025）

本文以葉綠素-a為起始原料，經(jīng)取代，加成等反應合成了一種新型葉綠素二氫卟吩衍生物132-N-（2-羥乙基）-153N-（2-羥乙基）-173-甲氧羰基二氫卟吩e6-131-152-二酰胺（Chlorin Amide e6，簡稱CAE）,其化學結構均經(jīng)UV-Vis，1H NMR，13C NMR及元素分析予以證實。通過對CAE合成工藝研究找到了最佳合成條件，并對光學性質(zhì)和合成反應機理進行了研究。

葉綠素-a；二氫卟吩；合成工藝；光學性質(zhì)；反應機理

光動力療法（Photodynamic therapy簡稱PDT）是在氧的參與下，光敏劑經(jīng)一定波長（630～800nm）光照射，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen substance,簡稱ROS）進而殺死癌變組織而不損傷正常組織的一種治療方法[1-4]。光敏劑接受特定波長光的光能后,由基態(tài)變成激發(fā)態(tài),處于激發(fā)態(tài)的光敏物質(zhì)很不穩(wěn)定,迅速經(jīng)過化學退激過程釋放出能量而返回基態(tài),在有氧條件下,這一能量釋放的過程,產(chǎn)生單線態(tài)氧，使細胞的結構和功能受到嚴重影響,從而干擾腫瘤細胞的生長并導致其死亡[5]。在光動力療法中，光敏劑、光和氧是必不可少的三要素，其中光敏劑是光動力療法的核心[6]。傳統(tǒng)光敏劑存在光穿透組織深度有限，水溶性較差，容易在體內(nèi)沉積等缺點[7]。為了克服這些缺點，近幾年發(fā)展了葉綠素二氫卟吩光敏劑[8]。葉綠素（Chls）是自然界最重要的色素，具有π共軛環(huán)四吡咯結構，在一個吡咯環(huán)外連接一個五元環(huán)。葉綠素-a在藍光區(qū)（～430nm）和紅光區(qū)（～660nm）有強烈的吸收,同時是很好的熒光團，且具有較高的量子產(chǎn)率[9]。因此，葉綠素二輕卟吩成為了理想光敏劑之一。

本課題組致力于研究葉綠素二氫卟吩光敏劑，并取得了一定的成果[10,11]?；谇捌谘芯浚疚囊匀~綠素-a為起始原料，經(jīng)5%硫酸甲醇溶液降解得到脫鎂葉綠酸-a甲酯（Mpa），然后在其13位和15位引入醇酰胺，得到了132-N-（2-羥乙基）-153-N-（2-羥乙基）-173-甲氧羰基二氫卟吩e6-131-152-二酰胺（Chlorin Amide e6，簡稱CAE）。本文細致研究了CAE的制備工藝，并討論它的合成機理，同時對其光學性質(zhì)（紫外可見吸收光譜、熒光光譜）進行了系統(tǒng)的研究。

圖1 CAE的合成路線Fig.1 The synthetic route of CAE

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Perkin-Elmer2400型元素分析儀；Varian-400型核磁共振儀（TMS為內(nèi)標）；島津UV-vis 2600紫外分光光度儀；Perkin-Elmer LS55熒光分光光度儀。

所用試劑均為分析純，脫鎂葉綠酸-a甲酯（Mpa）按文獻[12]制備。

1.2 CAE的合成

將50mg（0.0824mmol）Mpa溶解于12mL三氯甲烷中，攪拌下加入0.025mL乙醇胺，N2保護下室溫避光攪拌2h。濃縮反應混合物，室溫下靜置10h。依次加入30mL二氯甲烷和30mL水，分出二氯甲烷層，用30mL水洗3遍，加入無水Na2SO4干燥，經(jīng)硅膠柱層析分離，洗脫劑為V（甲醇）∶V（二氯甲烷）=1∶15，得到黑色固體粉末，產(chǎn)率為60%。UV-vis（EtOH）λmax（relative intensity）:399（1.392）,499.5（0.122）, 527（0.033）,607（0.042）,662.5（0.457）nm;1H-NMR（400 MHz,CDCl3）δ 9.61（s,1H,5-H）,9.60（s,1H, 10-H）,8.79（s,1H,20-H）,8.04（dd,J=17.8,11.5 Hz,1H,31H）,6.34（d,J=18.5 Hz,1H,1H,32-H（E））, 6.14（d,J=11.5Hz,1H,32-H（Z））,5.40-5.27（m,2H, 15-CH2）,4.44（m,1H,18-H）,4.33（m,1H,17-H）,3.94-3. 76（m,4H,155-CH2,134-CH2）,3.74-3.64（m,2H, 81-CH2）,3.56（s,3H,173-OCH3）,3.47（s,3H, 12-CH3）,3.46（s,3H,2-CH3）,3.26（s,3H,7-CH3）, 2.41（m,1H,171-CH2）,2.25-2.07（m,3H,171-CH2, 172-CH2）,1.70（d,J=7.2 Hz,3H,18-CH3）,1.66（t,J =7.6 Hz,3H,82-CH3）,1.30-1.04（m,4H,154-CH2, 133-CH2）,-1.77（s,1H,NH）,-1.98（s,1H,NH）.13C-NMR（MeOD-d4）δ（ppm）:10.8,11.8,17.8,18. 4,19.9,23.5,29.5,30.6,31.8,32.0,33.9,38.7,42.9, 44.1,50.4,52.8,54.5,58.3,61.6,61.7,94.8,99.1, 101.9,103.7,121.5,129.5,130.6,135.2,136.1,136.8, 139.7,145.4,149.9,155.0,168.9,170.9,172.0,175.3, 175.8.Anal.calcd for C39H48N6O6:C 67.22,H 6.94,N 12.06;found C67.08,H 6.99,N12.23.

2 結果與討論

2.1 CAE最佳合成條件的選擇

2.1.1 Mpa和乙醇胺摩爾比對產(chǎn)率的影響50mg（0.0824mmol）Mpa和乙醇胺分別按不同摩爾比反應，結果如表1。其他條件一致，溶劑為三氯甲烷（12mL），反應溫度25℃，反應時間2h，N2保護，避光。

表1 n（Mpa）∶n（乙醇胺）對產(chǎn)率的影響Tab.1 Influence of n（Mpa）∶n（ethanolamine）on yield

由表1可知，保持其它反應條件不變，只改變Mpa和乙醇胺摩爾比，反應產(chǎn)率不同。當Mpa和乙醇胺摩爾比逐漸增大至1∶5時，產(chǎn)率最大，繼續(xù)增大乙醇胺的量產(chǎn)率基本保持不變，因此Mpa和乙醇胺最佳摩爾比為1∶5。

2.1.2 反應時間對產(chǎn)率的影響50mg（0.0824mmol）Mpa和0.025mL乙醇胺按不同的時間反應，結果如表2。其他條件一致，n（Mpa）∶n（乙醇胺）=1∶5，溶劑為三氯甲烷（12mL），反應溫度25℃，N2保護，避光。

表2 反應時間對產(chǎn)率的影響Tab.2 Influence of reaction time on yield

由表2可知，當反應時間從0.5h增加至2.0h，產(chǎn)率逐漸提高，繼續(xù)增加反應時間產(chǎn)率基本保持不變，因此，Mpa和乙醇胺最佳反應時間為2h。

2.1.3 反應溫度對產(chǎn)率的影響50mg（0.0824mmol）Mpa和0.025mL乙醇胺在不同的溫度下反應，結果如表3。其他條件一致，n（Mpa）∶n（乙醇胺）=1∶5，溶劑為三氯甲烷（12mL），反應時間2h，N2保護，避光。

表3 反應溫度對產(chǎn)率的影響Tab.3 Influence of on reaction temperature

由表3可知，反應溫度從15℃增加到25℃，產(chǎn)率由55.7%增加至60.2%。繼續(xù)升溫至三氯甲烷回流，產(chǎn)率反而逐漸降低。分析認為，隨著溫度的升高CAE結構中17位酯基可以繼續(xù)和乙醇胺反應，得到副反應產(chǎn)物，因而產(chǎn)率降低。

綜合表1,2,3得出Mpa和乙醇胺最佳反應條件為：n（Mpa）∶n（乙醇胺）=1∶5；反應時間2h；反應溫度25℃。

2.1.4 最佳反應條件下多次試驗Mpa和乙醇胺在最佳反應條件下進行反應。反應條件固定為：n（Mpa）∶n（乙醇胺）=1∶5；反應時間2h；反應溫度25℃，N2保護，避光。5次同一條件下實驗，結果見表4。

表4 重復試驗結果Tab.4 The result of repeat experiments

由表4可知，重復5次平行試驗得到平均產(chǎn)率為60.2%。在此條件下反應產(chǎn)率穩(wěn)定可靠。

2.2 CAE光譜性質(zhì)研究

2.2.1 紫外可見吸收光譜紫外可見吸收光譜是鑒定葉綠素二氫卟吩類化合物的重要手段，同時也是光動力治療的重要依據(jù)。光動力治療的光范圍在630～800nm，在此范圍內(nèi)具有吸收峰的光敏劑均可用于光動力治療。典型的葉綠素二氫卟吩類化合物在400nm附近有一個Soret帶，在500～700nm有四個Q帶，其中在660～700nm的Q帶是敏感度和吸光度最強的Q帶。在本文中，紫外可見吸收光譜測試條件為：（1）波長范圍300～800nm；（2）溶劑為無水乙醇；（3）石英比色皿，寬度為1cm；（4）測試濃度為10-5mol·L-1；（5）測試溫度25℃。CAE溶解在無水乙醇溶液中后在300～800nm吸收譜見圖3。

圖3 CAE紫外可見吸收光譜Fig.3 Ultraviolet visible absorption spectra of CAE

所有可見光區(qū)都有電子吸收譜帶。最強的吸峰在399nm稱為Soret峰，吸光度為1.392。在更長波長的吸收峰稱為Q峰。499.5nm，527nm，607nm，662.5nm是4個Q峰，依次標記為Qx（0,1），Qx（0,0），Qy（0,1）和Qy（0,0），吸光度依次為0.122，0.003，0.042，0.457。x，y分別為偶極矩方向（如圖4）。

Qy（0,0）峰比其他Q峰強度大，是葉綠素二氫卟吩特征吸收峰。CAE在Soret帶以及Q帶均有吸收，由此可推斷其結構具有葉綠素二輕卟吩類化合物特征。雖然和Mpa相比Qy（0,0）吸收峰藍移5.5nm，但是CAE的Qy（0,0）吸光度為0.457大于Mpa（0.443），水溶性遠遠大于Mpa，使得CAE作為光敏劑可以溶于血液，加之由于存在18-π電子芳香大環(huán)結構具有一定的脂溶性，CAE更容易滲透細胞膜富集在腫瘤細胞，最終將其殺死。

2.2.2 熒光光譜光動力治療中光參與兩個過程：（1）葉綠素二氫卟吩類光敏劑吸收630～800nm光；（2）吸收光后，葉綠素二氫卟吩類光敏劑由激發(fā)態(tài)S0激發(fā)至激發(fā)態(tài)S1,S2，……，由第一激發(fā)態(tài)S1返回至基態(tài)S0時發(fā)出熒光。光敏劑將發(fā)出的熒光傳遞至氧分子，氧分子接受光能后由三線態(tài)氧轉變至單線態(tài)氧，從而不可逆轉的破壞核酸，酶類和細胞的一些成分如線粒體，血漿以及核膜，最終導致腫瘤細胞程序性死亡[13]。光敏劑吸收近紅外區(qū)域光后能否發(fā)出熒光以及熒光量子產(chǎn)率是光動力治療的關鍵，發(fā)出的熒光越強，熒光量子產(chǎn)率越高，產(chǎn)生單線態(tài)氧的含量就越多，殺死腫瘤細胞的效果越好。因此，對光敏劑熒光光學性質(zhì)的研究至關重要。CAE含有二氮雜[18]輪烯的芳香性碳架結構，具有非常強的共軛效，超強的共軛效應使得CAE吸收一定波長的光后能夠發(fā)射強烈的熒光。本文中熒光光譜測試條件：（1）激發(fā)波長412nm；（2）狹縫寬度10nm/10nm；（3）溶劑為無水乙醇；（4）測試濃度10-5mol·L-1；（5）測試溫度為25℃。用412nm光激發(fā)得到CAE熒光發(fā)射光譜見圖5。

圖5 CAE熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of CAE

412nm激發(fā)后得到一個熒光發(fā)射峰，發(fā)射波長為669.5nm，熒光強度為890.9，雖然CAE熒光發(fā)射峰和Mpa相比藍移6nm，但是其熒光強度高于高于Mpa（760.8），熒光量子產(chǎn)率高于Mpa，產(chǎn)生的單線態(tài)氧也較多，從而殺死腫瘤細胞結果要好。因此CAE作為光動力治療中的光敏劑比Mpa更具有優(yōu)勢。

2.3 CAE合成機理

本文還探討了CAE的反應機理，見圖6。

脫鎂葉綠酸-a甲酯131羰基-C=O中，由于O原子的電負性大于C原子的電負性，使得-C=O中雙鍵的電子云傾向于O原子，這樣-C=O中C原子具有一定的正電性。乙醇胺中N原子有一對孤電子，依據(jù)正負電荷相吸原理，乙醇胺中N原子首先加成到羰基C原子上，將雙鍵打開，形成中間體Ⅰ。在中間體Ⅰ中151C原子帶負電，132N原子帶正電，該結構不穩(wěn)定迅速轉變?yōu)檩^穩(wěn)定的中間體Ⅱ，中間體Ⅱ經(jīng)分子內(nèi)質(zhì)子轉移形成分子Ⅲ。由于乙醇胺過量，帶有孤對電子的N原子繼續(xù)進攻152羰基C原子形成中間體Ⅳ，經(jīng)分子內(nèi)質(zhì)子轉移將N原子上的質(zhì)子H轉移至甲氧基，質(zhì)子化的甲氧基很容易脫去CH3OH，同時帶負電的O原子和帶正電的C原子形成-C=O，最終得到CAE。

圖6 CAE合成反應機理Fig.6 The reaction mechanism of CAE

3 結論

本文合成了一種新型葉綠素類二氫卟吩衍生物132N-（2-羥乙基）-153N-（2-羥乙基）-173-甲氧羰基二氫卟吩e6-131-152-二酰胺（CAE）。通過合成工藝研究得出CAE的最佳合成條件為：n（Mpa）∶n（乙醇胺）=1∶5；反應時間2h；反應溫度25℃。羥基的引入使水溶性大幅增加，彌補了傳統(tǒng)光敏劑水溶性差的缺點。光譜學研究可知，CAE在662.5nm有一較強的紫外吸收峰，在669.5nm處有較強的熒光發(fā)射峰，吸光度和熒光強度均大于Mpa。CAE這種較強的紫外吸收能力和較高的熒光強度，使其具有作為新型光敏劑用于光動力治療的潛力。本文還對CAE合成機理進行了研究，為以后類似物化合物的合成提供了理論基礎。

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Synthesis procedure and optical quality of 132-N-（2-hydroxyethyl）-153-N-（2-hydroxyethyl）-17-3-methoxycarbonyl-chlorin e6-13-1-15-2-diamide and optical quality*

ZHU Guo-hua，JIN Ying-xue*
（College of Chemistry&Chemical Engineering,Harbin Normal University,Harbin 150025,China）

On the basis of chlorophyll-a as starting material,a new chlorophyll chlorine derivative named 132-N-（2-hydroxyethyl）-153-N-（2-hydroxyethyl）-173-methoxycarbonylchlorine6-131-152-diamide（simple named CAE）was synthesized via a series of chemical reaction such as addition and substitution.The chemical structures of the unreported chlorin were characterized by UV-Vis,1H NMR,13C NMR and elemental analysis.We find the optimum conditions of the synthesisits by researching synthesis procedure of CAE.At the same time,optical quality and mechanism were also researched.

chlorophyll-a；chlorin；synthesis procedure；optical quality；reaction mechanism

O626.13

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20150401

2015-01-12

國家自然科學基金（No.21272048,21171045）；黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團隊建設計劃（No.2011TD010）資助項目

朱國華（1988-），男，陜西，在讀碩士研究生，有機合成。

金英學（1966-），男，教授，博士，有機合成。