化療對胃癌SPARC表型的影響

高永銀 韓如冰 王霞 葛少華 李鴻立 鄧婷 巴一 黃鼎智

·臨床研究與應(yīng)用·

化療對胃癌SPARC表型的影響

高永銀 韓如冰 王霞 葛少華 李鴻立 鄧婷 巴一 黃鼎智

目的：本研究旨在探討化療對胃癌SPARC（secreted protein，acidic and rich in cysteine）表型的影響。方法：免疫組織化學(xué)方法檢測132例胃癌組織中SPARC的表達情況。132例胃癌組織中，54例取自新輔助化療后手術(shù)胃癌患者，78例取自無新輔助化療手術(shù)的胃癌患者，以免疫組織化學(xué)方法檢測各例組織標本中SPARC的表達，分析化療對SPARC表型影響。結(jié)果：較正常胃組織及腫瘤細胞周圍的間質(zhì)組織，SPARC在胃癌細胞中高表達；SPARC高表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。新輔助化療組的SPARC高表達比例較無新輔助化療的對照組低（P＜0.05）。單因素分析表明大體類型、組織學(xué)類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、新輔助化療后SPARC表型表達為新輔助化療后手術(shù)組胃癌患者的預(yù)后影響因子；多因素分析表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型、新輔助化療后SPARC表型表達為獨立的預(yù)后影響因子。結(jié)論：SPARC表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及胃癌患者預(yù)后相關(guān)；新輔助化療可改變胃癌SPARC表型。

SPARC 胃癌 免疫組化 化療

胃癌為第四大常見惡性腫瘤，死亡率高居腫瘤死亡率第二位［1］。由于腫瘤細胞對藥物敏感性有限，化療整體療效欠佳，緩解率約10%～40%，中位生存僅11個月［1］。研究顯示對于HER-2陽性表型的胃癌患者在化療基礎(chǔ)上聯(lián)合曲妥珠單抗可進一步延長生存期2.7個月［2］。胃癌是一種分子表型高度異質(zhì)性的腫瘤，針對不同表型胃癌的個體化治療是提高療效的關(guān)鍵。有效的個體化治療取決于對胃癌準確的分子分型和合理運用有效藥物。

白蛋白紫杉醇（nanoparticle albumin-bound paclitaxel，nab-paclitaxel）是一種白蛋白與紫杉醇微粒結(jié)合的新型紫杉醇制劑，在乳腺癌［3］和胰腺癌［4］顯示出顯著的療效，在晚期和復(fù)發(fā)胃癌的二線化療也顯示出令人鼓舞的療效，達到緩解率27.8%，總生存9.2個月［5］，成為胃癌化療的一個重要的新武器。研究表明白蛋白紫杉醇對腫瘤產(chǎn)生較高療效的重要機制之一是通過與腫瘤組織中的SPARC結(jié)合，使進入腫瘤細胞的藥物濃度增加［5-6］。

SPARC蛋白為一種細胞外基質(zhì)糖蛋白［7］，其表達與多種腫瘤的增殖、遷移、抗黏附、血管生成等密切相

關(guān)［8］。在胃癌中，SPARC表達與腫瘤細胞的侵襲、遷移、胃癌患者的預(yù)后［9］及對多西他賽的療效相關(guān)［10］。此外，有報道SPARC蛋白表達與胰腺癌患者預(yù)后［11］及白蛋白紫杉醇在頭頸部腫瘤中的療效相關(guān)［12］。這些研究提示SPARC蛋白是一種與紫杉醇類藥物尤其是白蛋白紫杉醇療效密切相關(guān)的重要的分子表型。在肺癌［13］及乳腺癌［14］的研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤的分子表型可以在化療后發(fā)生改變，但在胃癌中化療是否會影響SPARC表型尚未明確。探討在化療干預(yù)下胃癌患者SPARC表型是否發(fā)生改變，對化療藥物的選擇和治療策略的制定有重要臨床指導(dǎo)意義。

本研究旨在探討化療對胃癌SPARC表型影響；同時對SPARC在胃癌中的表達分布及其與臨床病理因素的關(guān)系作進一步研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料132例胃腺癌組織標本均來自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2007年1月至2012年12月手術(shù)切除標本（因胃鏡咬檢組織過小故未采用），全部標本均經(jīng)病理證實為胃腺癌，正常對照胃組織標本取自遠離癌組織一側(cè)的陰性切端。132例患者中，54例行新輔助化療后術(shù)后的腫瘤標本（A組）和78例無新輔助化療術(shù)后的腫瘤標本（B組），用于分析化療對SPARC表型影響；A組中，15例行以紫杉類為主的新輔助化療方案，39例行以鉑類+氟尿嘧啶類為主的方案。本研究符合醫(yī)院倫理委員會認可。

1.1.2主要試劑SPARC兔抗人多克隆抗體購自英國Abcom公司；二抗為即用型免疫組織化學(xué)Elivision plus試劑盒（鼠/兔），購自中國邁新生物技術(shù)有限公司。1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法檢測胃癌組織中SPARC表達胃癌石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸鈉緩沖液抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；SPARC一抗4℃孵育過夜；滴加酶標記的二抗。DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，待目的蛋白著色而背景未著色時終止顯色；蘇木精復(fù)染，常規(guī)酒精梯度脫水，封片鏡檢。以PBS代替一抗為陰性對照，胰腺癌組織為陽性對照。

1.2.2結(jié)果判定SPARC在胃癌中陽性染色為胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。光鏡下隨機觀察10個高倍鏡視野，按著色程度評分［9］：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再依據(jù)染色細胞所占百分比評分：陽性細胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分；兩項乘積即染色指數(shù)為該例免疫組織化學(xué)得分，染色指數(shù)≥4為SPARC高表達，染色指數(shù)≤3為SPARC低表達。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析；單因素Kaplan-Meier生存分析和多因素Cox生存分析模型分析胃癌患者預(yù)后的相關(guān)因素。隨訪時間以診斷時間為起點，死亡或到2014年6月為終點。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SPARC蛋白在胃癌組織中的表達情況

在24例正常對照胃黏膜組織中（B組），SPARC低表達于70.8%（17/24）胃腺細胞及66.7%（16/24）間質(zhì)細胞（圖1）；在78例胃癌組織中（B組），SPARC高表達于70.5%（55/78）腫瘤細胞，SPARC在腫瘤周圍的間質(zhì)細胞均低表達；表達部位主要在腫瘤細胞胞漿（圖1）。

圖1 免疫組織化學(xué)方法檢測SPARC在胃腺癌中的表達情況（IHC× 200）Figure 1SPARC expression in gastric cancer as determined by immunohistochemistry（IHC×200）

2.2SPARC蛋白表達與胃癌患者臨床病理因素關(guān)系

78例（B組）無新輔助化療患者的術(shù)后胃癌組織標本中，SPARC高表達與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)（P＜0.05，表1），與其他臨床病理因素?zé)o相關(guān)性（P＞0.05，表1）。

2.3化療對胃癌SPARC表型的影響

對54例新輔助化療患者（A組）術(shù)后胃癌組織標本與78例無新輔助化療患者（B組）的術(shù)后胃癌組織標本中的SPARC表達進行分析，結(jié)果顯示A組中SPARC高表達的百分比較B組低（46.3%vs.70.5%，P＜0.05，圖2）；進一步對A組新輔助化療方案進行分

析，結(jié)果顯示27.8%（15/54）胃癌患者行以紫杉類為主的方案化療，其中60.0%患者化療術(shù)后的SPARC低表達；72.2%（39/54）胃癌患者行以鉑類+氟尿嘧啶類為主方案化療，其中51.2%患者化療術(shù)后的SPARC低表達。

表178 例無新輔助化療胃癌患者SPARC蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系Table 1Correlation between the SPARC expression and clinicopathologic features of gastric cancer patients without preoperative chemotherapy

2.4SPARC表型與胃癌患者預(yù)后關(guān)系

132例胃癌患者（A組+B組）中，SPARC表型與患者預(yù)后無顯著相關(guān)性，SPARC高表達的胃癌患者2年生存率為60.6%，低表達的胃癌患者2年生存率為64.1%（P=0.193）；進一步對54例新輔助化療后手術(shù)胃癌患者（A組）的生存分析顯示，化療后SPARC表

圖2 化療對胃癌SPARC表型的影響（IHC×200）Figure 2SPARC phenotype in relation to chemotherapy（IHC×200）

圖3 新輔助化療后SPARC表型與預(yù)后關(guān)系Figure 3SPARC phenotype after preoperative chemotherapy in relation to overall survival

對A組患者預(yù)后相關(guān)的其他臨床病理因素進行單因素分析，結(jié)果表明大體類型（BorrmannⅠ/Ⅱ，BorrmannⅢ/Ⅳ；P=0.015）、組織學(xué)分型（腸型，彌漫型；P=0.042）、浸潤深度（T1/T2，T3/T4；P=0.034）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0，N+；P=0.002）、TNM分期（Ⅰ/Ⅱ，Ⅲ；P= 0.001）為預(yù)后影響因素；進一步多因素Cox分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.032）、組織學(xué)分型（P=0.027）及新輔助化療后的SPARC表型（P=0.024）為A組患者的獨立的預(yù)后影響因子。

3 討論

SPARC蛋白在胃癌中過表達并與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移、凋亡及患者預(yù)后相關(guān)［9，15-16］。相關(guān)研究報道胃癌細胞中SPARC的高表達可促進癌細胞的侵襲［17］、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移，高表達患者預(yù)后差［9，18］；然而另有研究認為SPARC高表達抑制血管生成［19］、癌細胞增殖［15，20］，腫瘤間質(zhì)細胞中SPARC高表達與臨床病理因素呈負相關(guān)［15］。因此，本研究為進一步探討SPARC與胃癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系，對SPARC在胃癌組織中表達及部位進行檢測，并分析與臨床病理因素的關(guān)系。

SPARC主要表達于腫瘤細胞或腫瘤間質(zhì)細胞，型與患者預(yù)后相關(guān)，SPARC高表達患者的1、2、3年生存率分別為43.5%、27.0%、13.0%；低表達患者的1、2、3年生存率分別為81.8%、72.7%、56.7%（P=0.002，圖3）。

與腫瘤類型相關(guān)［18］。本研究中，SPARC主要高表達于胃癌細胞中，低表達于腫瘤間質(zhì)細胞及正常胃黏膜組織；該結(jié)果與Zhao等［9］和Wang等［18］的研究結(jié)果一致。但在另外一些研究結(jié)果與之相反，SPRAC在腫瘤間質(zhì)細胞中高表達［15，20-21］，且與臨床病理因素［15］及Ki-67［20］呈負相關(guān)。因此，通過對以上研究分析，推測SPARC表達部位在胃癌細胞或間質(zhì)細胞或許決定了其在胃癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用，但需對相關(guān)分子機制進一步研究來證實。

本研究中，SPARC高表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，該結(jié)果與Wang等［18］和Zhao等［9］研究結(jié)果一致。研究表明SPARC可能在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程的最初階段發(fā)揮作用［22］，并可能通過活化相關(guān)基質(zhì)降解酶來促進癌細胞的轉(zhuǎn)移播散［23］。在胃癌中，既往研究報道SPARC高表達的患者預(yù)后較差［9，21］。與之不同，本研究中SPARC表型并未顯示出明顯預(yù)后價值。但亞組分析顯示在新輔助化療后手術(shù)組患者（A組）中，化療后SPARC高表達者預(yù)后更差，可能與樣本量較小有關(guān)。但值得關(guān)注的是，在一項最新的乳腺癌研究中也發(fā)現(xiàn)與本研究相似的現(xiàn)象，腫瘤分子標志物在新輔助化療前與預(yù)后無關(guān)，但在新輔助化療后的表達與預(yù)后明顯相關(guān)［24］，其機制與意義仍需進一步探討。

腫瘤的個體化治療需要分子分型，但腫瘤分子標志物于化療前后可出現(xiàn)變化［13-14］，分子表型的變化對后續(xù)治療用藥的選擇無疑具有重要影響。本研究中，新輔助組化療后的SPARC高表達百分比較無新輔助化療的對照組減低（46.3%vs.70.5%），即新輔助化療可改變胃癌SPARC表型。可能的機制包括SPARC高表達的癌細胞被殺滅后，腫瘤組織富集了SPARC陰性和低表達細胞，或者化療藥物引起癌細胞內(nèi)在基因的變化。

對本研究中新輔助化療組的化療方案進行分析，結(jié)果表明以紫杉類為主方案化療的患者中，60.0%患者在新輔助化療后SPARC低表達，而以鉑類聯(lián)合氟尿嘧啶類為主方案化療的患者中，51.2%患者在化療后SPARC低表達。研究表明白蛋白紫杉醇在二線治療晚期或復(fù)發(fā)性胃癌患者中顯示了良好的療效。值得注意的是，白蛋白紫杉醇療效與SPARC蛋白表型相關(guān)［5］，但本研究結(jié)果顯示對既往接受過化療尤其是紫杉類藥物胃癌患者其SPARC表型可能發(fā)生變化，在應(yīng)用白蛋白紫杉醇前應(yīng)考慮重新活檢檢測SPARC蛋白的表達。本研究探索化療對胃癌SPARC分子表型影響，樣本量仍顯不足，未來需要進一步擴大樣本驗證。

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（2014-11-13收稿）

（2015-01-06修回）

（編輯：鄭莉）

Effect of chemotherapy on the phenotype of secreted protein，acidic and rich in cysteine in gastric cancer

Yongyin GAO，Rubing HAN，Xia WANG，Shaohua GE，Hongli LI，Ting DENG，Yi BA，Dingzhi HUANG

Dingzhi HUANG；E-mail:dingzhih72@163.com

Objective:To investigate the influence of chemotherapy on the phenotype of secreted protein，acidic and rich in cysteine（SPARC）in gastric cancer（GC）.Methods:Immunohistochemistry was used to analyze SPARC expression in 132 GC patients.Among these patients，54 with preoperative chemotherapy and 78 without preoperative chemotherapy were selected to analyze the effect of chemotherapy on SPARC phenotype by comparing the postoperative specimens of the two cohorts.Results:SPARC expression was higher in GC lesions than in the desmoplastic stroma surrounding the tumor cells and noncancerous tissues.High SPARC expression was related to invasion depth，lymph node metastasis，and TNM staging.SPARC expression was lower in patients with preoperative chemotherapy than in controls（P＜0.05）.Gross type，histology，depth of invasion，lymph node metastasis，TNM staging，and SPARC phenotype correlated with the overall survival of the patients with preoperative chemotherapy.Further multivariate analysis suggested that lymph node metastasis，histology，and SPARC phenotype after chemotherapy were independent prognostic indicators of GC.Conclusion:SPARC expression was associated with invasion depth，lymph node metastasis，TNM staging and GC prognosis.Preoperative chemotherapy may change the phenotype of SPARC in GC patients.

SPARC，gastric cancer，immunohistochemistry，chemotherapy

10.3969/j.issn.1000-8179.20141913

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院消化腫瘤內(nèi)科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）

黃鼎智dingzhih72@163.com

Department of Gastrointestinal Medical Oncology，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research

Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China

高永銀專業(yè)方向為消化道惡性腫瘤的治療與研究。

E-mail：xiaoshugao@126.com