分子模擬技術(shù)及其在蘋果蠹蛾代謝殺蟲劑分子機(jī)制研究中的應(yīng)用進(jìn)展

楊雪清，劉吉元，張雅林

1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽110866;2西北農(nóng)林科技大學(xué)植保資源利用與病蟲害防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100;3中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)教研室，陜西西安710032

蘋果蠹蛾Cydia pomonella(L.)屬鱗翅目卷蛾科小卷蛾屬，是世界性的果樹重要害蟲(Fuentes-Contreras et al.，2007;Reyes et al.，2011;Voudouris et al.，2011)，也是我國重要的檢疫性害蟲之一。頻繁使用化學(xué)殺蟲劑使得蘋果蠹蛾種群對各類化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性(Brun-Barale et al.，2005;Reyes et al.，2007;Yang ＆ Zhang，2015)。蘋果蠹蛾對殺蟲劑抗性的機(jī)理研究是近年來的研究熱點(diǎn)，其中解毒代謝增強(qiáng)是蘋果蠹蛾抗藥性最普遍的機(jī)制(Reyes et al.，2007)。蘋果蠹蛾中參與解毒代謝的酶系包括多功能氧化酶(MFO)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)和羧酸酯酶(CarE)(Rodríguez et al.，2011;Voudouris et al.，2011)。然而目前從分子水平研究蘋果蠹蛾解毒酶代謝殺蟲劑分子機(jī)制的研究還相對較少。

當(dāng)殺蟲劑作用于昆蟲后，靶蛋白、解毒酶以及殺蟲劑分子之間必然存在著相互識別、相互反應(yīng)和信息傳遞，并伴隨著分子間的靜電相互作用、范德瓦斯相互作用和疏水相互作用以及化學(xué)鍵的形成和斷裂。然而，通過傳統(tǒng)的試驗(yàn)手段研究上述反應(yīng)過程中的每個步驟都十分困難。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、量子化學(xué)、生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等研究學(xué)科的快速發(fā)展，使得利用分子模擬技術(shù)研究解毒酶—?dú)⑾x劑的相互作用、揭示代謝殺蟲劑的分子機(jī)制以及殺蟲劑的合理設(shè)計(jì)與改造和對解毒酶的定點(diǎn)突變改造成為了可能。分子模擬(Molecular simulation，MS)是以計(jì)算機(jī)技術(shù)為依托，以量子化學(xué)、統(tǒng)計(jì)力學(xué)為理論基礎(chǔ)，對物理和化學(xué)過程中分子的微觀行為進(jìn)行仿真的一門新興學(xué)科(陳正隆等，2007;呂玲紅等，2014)。

1 分子模擬方法

目前，分子模擬廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)中，用于認(rèn)知、預(yù)測和模擬蛋白質(zhì)、核酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以及模擬DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)。分子模擬方法主要有量子力學(xué)方法(Quantum mechanics，QM)、分子力學(xué)方法(Molecular mechanics，MM)、分子動力學(xué)(Molecular dynamics，MD)和蒙地卡羅方法(Monte carlo，MC)(陳正隆等，2007)。

2 分子模擬研究涉及的主要方法

2.1 同源模建

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能。但要獲得一個蛋白質(zhì)準(zhǔn)確的分子結(jié)構(gòu)并不容易。在傳統(tǒng)方法中，X-射線單晶衍射技術(shù)和核磁共振技術(shù)(NMR)是解析蛋白分子結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法，但前者需要將純化的靶蛋白(＞10 mg·mL-1)結(jié)晶，而許多蛋白質(zhì)在如此高的表達(dá)量時容易形成包涵體，需要通過變/復(fù)性才能使蛋白質(zhì)正確折疊;后者則要求靶蛋白在非常高的濃度下可溶、穩(wěn)定、不聚集，且該技術(shù)難以解析大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。此外，解析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)費(fèi)時費(fèi)力，花費(fèi)巨大(劉吉元，2014)。

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測是目前研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的一個快速、有效、低廉的手段，包括從頭預(yù)測法、比較模建法和折疊識別法(Cozzetto ＆ Tramontano，2005)。其中，比較模建法又稱同源模建(Homology modeling)，是目前最成熟、最常用的預(yù)測方法。Swiss model(Schwede et al.，2003)和Modeller是目前最常用的免費(fèi)同源構(gòu)建工具。除此之外，Sybyl、Discovery Studio 和MOE 等商業(yè)化軟件也可用于同源模建。學(xué)者普遍認(rèn)為，蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中三維結(jié)構(gòu)的保守性遠(yuǎn)大于氨基酸序列的保守性。因此，當(dāng)2 個蛋白質(zhì)氨基酸序列的一致性超過30%時，它們的三維結(jié)構(gòu)高度一致。根據(jù)該理論，對于一個未知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，只要在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein data bank，PDB)中找到與其同源性較高、晶體結(jié)構(gòu)的R-factor 以及解析度較好的蛋白質(zhì)，便能以該蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)為模板，構(gòu)建未知蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型(劉吉元，2014)。對構(gòu)建好的結(jié)構(gòu)模型還需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和評估。目前常用的模型評估方法主要有拉氏分布圖、Contact 曲線圖、Profiles-3D 等(Luethy et al.，1992)。同源模建過程見圖1。

2.2 分子對接

深入研究蛋白質(zhì)(受體)與小分子(配體)的相互作用，需要獲得準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)—小分子復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)。分子對接(Molecular docking)是分子模擬的重要方法之一，是預(yù)測蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合模式的重要手段。在受體—配體相互作用過程中，主要有2 個學(xué)說，即“Lock and key”學(xué)說(也稱“鎖鑰”學(xué)說)和“Induced fit”學(xué)說(又稱“誘導(dǎo)契合”學(xué)說)?！版i鑰學(xué)說”指的是，藥物(配體)與蛋白質(zhì)分子(受體)相互識別過程類似于鑰匙與鎖關(guān)系，這種識別關(guān)系認(rèn)為受體與配體相互識別是剛性的幾何結(jié)構(gòu)匹配過程，只有當(dāng)它們的立體結(jié)構(gòu)互補(bǔ)才能結(jié)合。隨著受體學(xué)說的發(fā)展，Koshland(1958)提出了“Induced fit”學(xué)說，他認(rèn)為受體與配體的形狀不一定是互補(bǔ)的，在受體與配體相互作用時，受體柔性的結(jié)合口袋會隨著配體的誘導(dǎo)而發(fā)生構(gòu)象上的變化，以達(dá)到最佳的互補(bǔ)性契合。通過分子對接確定復(fù)合物中的配體與受體的結(jié)合模式，研究它們之間關(guān)鍵的相互作用，為揭示配體的作用機(jī)制和設(shè)計(jì)新的配體提供了理論基礎(chǔ)。目前，分子對接廣泛應(yīng)用于藥物設(shè)計(jì)、材料設(shè)計(jì)等領(lǐng)域。

昆蟲解毒酶并不是殺蟲劑的作用靶標(biāo)(受體)，但許多殺蟲劑與解毒酶結(jié)合得十分緊密，它們的IC50甚至可達(dá)μmol·L-1級別(Liu et al.，2014;Prapanthadara et al.，1998;Yang et al.，2014)。因此，利用分子對接研究解毒酶和殺蟲劑的相互作用，已經(jīng)成為研究害蟲代謝殺蟲劑分子機(jī)制的重要手段。

圖1 同源模建示意圖(以CpCE-1 為例)(引自Yang et al.，2014)Fig.1 Schematic diagram of Homology modeling (a case study of CpCE-1)(quoted from Yang et al.，2014))

隨著受體學(xué)說的不斷完善，分子對接模型從基于幾何空間匹配的剛性模型發(fā)展成為基于幾何空間匹配與能量匹配的柔性模型。幾何空間匹配是蛋白質(zhì)與配體之間產(chǎn)生相互作用的基礎(chǔ)，能量匹配是分子間保持穩(wěn)定結(jié)合的基礎(chǔ)。各種分子對接方法對體系均有一定的簡化，根據(jù)簡化的程度和方式，可以將分子對接分為3 類:剛性對接、半柔性對接和柔性對接。剛性對接是指在計(jì)算過程中，配體與受體的構(gòu)像均不發(fā)生變化，適用于大分子之間的對接。該方法簡化程度最高，計(jì)算量相對較小且粗略;半柔性對接是指對接過程中小分子的構(gòu)像發(fā)生一定程度的變化，但大分子的構(gòu)像保持不變或僅有部分氨基酸殘基發(fā)生構(gòu)象變化。半柔性對接在對接精確度和計(jì)算量方法采取了折中的策略，應(yīng)用非常廣泛，Dock 和Autodock 是目前應(yīng)用最為廣泛的分子對接軟件;柔性對接方法在對接過程中允許研究體系的構(gòu)像發(fā)生自由變化，由于變量隨著體系的原子數(shù)呈幾何級數(shù)增長，因此柔性對接方法的計(jì)算量非常大，適合精確考察分子間的識別情況，應(yīng)用有限，Accelrys 公司研發(fā)的Affinity(Affinity，Accelrys Inc.USA)就是用于柔性對接的工具(劉吉元，2014)。

2.3 分子動力學(xué)模擬

分子動力學(xué)模擬(Molecular dynamics simulations，MDS)是基于經(jīng)典力學(xué)、模擬生物大分子運(yùn)動行為的一種分子模擬方法。分子動力學(xué)模擬依靠牛頓力學(xué)模擬每個原子及體系的運(yùn)動，計(jì)算體系中所有原子的運(yùn)動軌跡，通過當(dāng)前狀態(tài)預(yù)測其在任意時刻的運(yùn)動狀態(tài)(劉吉元，2014)。分子動力學(xué)模擬的經(jīng)典牛頓運(yùn)動方程可表示為:

常規(guī)的分子動力學(xué)模擬流程包括初始構(gòu)型的確定、能量優(yōu)化與體系緩慢升溫(Heating)、平衡相(Equilibrium phase)和生產(chǎn)相(Production phase)4個階段。

目前，AMBER 是進(jìn)行分子動力學(xué)模擬最常用的分子力場。

2.4 結(jié)合自由能計(jì)算

受體和配體之間結(jié)合自由能(Binding free energy)是評價不同狀態(tài)下復(fù)合物穩(wěn)定性、描述分子間相互作用的核心問題數(shù)據(jù)。在配體和受體的相互作用過程中，牽涉到2 類相互作用，即非鍵相互作用和共價相互作用。非鍵相互作用包括靜電相互作用和范德瓦斯相互作用等，這些相互作用都可以通過力場計(jì)算進(jìn)行比較簡單的表達(dá);而共價相互作用則牽涉到化學(xué)鍵的斷裂和生成，需要用量子力學(xué)的方法進(jìn)行考察(劉吉元，2014)。在藥物分子和受體的相互作用時，一般只牽涉到非鍵相互作用;而共價相互作用只存在少數(shù)體系中。根據(jù)熱力學(xué)原理，結(jié)合自由能和結(jié)合常數(shù)Ki存在定量的關(guān)系(Ost et al.，2004):ΔG=-RTlnKi。

自由能的計(jì)算方法主要分為3 類:自由能微擾(Free energy perturbation，F(xiàn)EP)、熱力學(xué)積分(Thermodynamic integration，TI)、基于主方程的分子力學(xué)/泊松—波爾茲曼表面積方法(Molecular mechanics poisson-boltzmann surface area，MM-PBSA )(Chong et al.，1999;Gohlke ＆ Klebe，2002;Marco et al.，2005)。FEP 法在原理上比較嚴(yán)格，計(jì)算結(jié)果也較為精確，但需要長時間的數(shù)據(jù)采集，對計(jì)算體系有嚴(yán)格的限制，只能適合較為簡單的情況;TI 法把結(jié)合自由能分解為不同的相互作用能量項(xiàng)，通過一組訓(xùn)練集并利用統(tǒng)計(jì)方法得到自由能計(jì)算的經(jīng)驗(yàn)公式，取樣簡單，計(jì)算量小，但這類方法不能很好地考慮體系的柔性以及溶劑效應(yīng)，因此一般只能對一些體系做有限預(yù)測，只能作為初篩的手段;MMPBSA 法是近幾年發(fā)展起來的基于分子動力學(xué)采樣的自由能預(yù)測方法，該方法可用來計(jì)算配體與蛋白質(zhì)受體復(fù)合物體系的絕對和相對結(jié)合自由能(Srinivasan et al.，1998)。在此基礎(chǔ)上還派生了分子力學(xué)/廣義波恩表面積方法(Molecular mechanics generalized born surface area，MM-GBSA)(Kollman et al.，2000)。MM-PBSA 和MM-GBSA 這2 種方法都是基于分子動力學(xué)采樣，不需要通過線性擬合而得到經(jīng)驗(yàn)參數(shù)，對不同體系具有較好的普適性，計(jì)算速度快且結(jié)果較為準(zhǔn)確，已成為應(yīng)用前景最為廣闊的計(jì)算結(jié)合自由能的方法(劉吉元，2014)。

3 分子模擬在蘋果蠹蛾代謝抗性研究中的應(yīng)用

近年來，分子模擬技術(shù)在昆蟲解毒酶與殺蟲劑的相互作用中得到了一定程度的應(yīng)用。利用同源模建，Li et al.(2004)以芽孢桿菌CYP102 為模板構(gòu)建了棉鈴蟲Helibthis armigera Hübner CYP6B1 和CYP6B8 的3D模型，并成功預(yù)測了棉鈴蟲CYP6B1 和CYP6B8 的活性口袋和參與催化的關(guān)鍵氨基酸。Chiu et al.(2008)對岡比亞按蚊Anopheles gambiae Giles CYP6Z1 和CYP6Z2 的底物結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了比較，并利用分子模擬方法分析了CYP6Z1 和CYP6Z2 與DDT 的結(jié)合能力和對DDT 的潛在代謝能力;預(yù)測結(jié)果與代謝試驗(yàn)相吻合，表明CYP6Z1 能夠代謝DDT。Stevenson et al.(2011)將溴氰菊酯與岡比亞按蚊CYP6M2 進(jìn)行了對接，并發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯結(jié)合于靠近亞鐵血紅素催化中心的4'-苯氧基芐基。利用分子模擬和量子力學(xué)/分子力學(xué)(QM/MM)方法，Li et al.(2014)預(yù)測并證實(shí)了在岡比亞按蚊epsilon 家族的agGSTe-2 中，Arg 112、Glu 116 和Phe 120 對DDT 的代謝至關(guān)重要。然而，分子模擬技術(shù)在蘋果蠹蛾代謝殺蟲劑分子機(jī)制研究中的應(yīng)用尚處于起步階段。

3.1 在蘋果蠹蛾GSTs 代謝殺蟲劑分子機(jī)制研究中的應(yīng)用

近年來，越來越多的昆蟲GSTs 蛋白晶體結(jié)構(gòu)得到解析，促使昆蟲GSTs 代謝殺蟲劑分子機(jī)制的研究進(jìn)入了一個新的局面。Chen et al.(2003)從DDT 抗性岡比亞按蚊中解析了一個δ 家族的GST蛋白agGSTd1-6 的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 1pn9)，該蛋白由8 個α-螺旋和4 個β-折疊構(gòu)成，這是昆蟲中第一個解析的GST 晶體結(jié)構(gòu)，也拉開了昆蟲GSTs 蛋白結(jié)構(gòu)研究和利用同源模建研究昆蟲GSTs功能的序幕。此后，Kakuta et al.(2013)解析了家蠶GST 蛋白bmGSTu 的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:3AY8)，并發(fā)現(xiàn)該蛋白中谷胱甘肽結(jié)合區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基Val 55、Glu 67、Ser 68、Tyr 7 和Ser 12 對GST 的催化功能至關(guān)重要。

以agGSTd1-6 晶體結(jié)構(gòu)為模板，利用同源模建技術(shù)，Liu et al.(2014)構(gòu)建了蘋果蠹蛾CpGST1 的三維結(jié)構(gòu)。利用高效液相色譜檢測，Liu et al.(2014)發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)的CpGST1 蛋白能代謝高效氯氟氰菊酯，但不能代謝甲基毒死蜱。CpGST1 活性位點(diǎn)包含2 個亞位點(diǎn)，即GSH 結(jié)合位點(diǎn)(G 位點(diǎn))和疏水性結(jié)合位點(diǎn)(H 位點(diǎn))。其中，G 位點(diǎn)由主要的親水和極性的氨基酸殘基Ser 10、Gln 39、His 51、Thr 52、Val 53、Glu 65、Ser 66 和Arg 67 組成;H 位點(diǎn)由疏水性的氨基酸殘基Val 7、Ala 11、Pro 12、Leu 34、His 35、Tyr 106、Phe 109、Tyr 114、Leu 117、Phe 118、Phe 205 和Val 209 組成。通過分子對接發(fā)現(xiàn)，高效氯氟氰菊酯的苯醚基團(tuán)主要占據(jù)了蛋白活性位點(diǎn)中的H 亞位點(diǎn)，而其余基團(tuán)與G位點(diǎn)中的氨基酸殘基相互作用;苯醚基團(tuán)與Val 7、Ala 11、Leu 34、Tyr 114、Phe 118、Phe 205 和Val 209之間具有較強(qiáng)的疏水作用，三氟甲基上的氟原子與Gln 50 具有極性作用。此外，高效氯氟氰菊酯與CpGST1 形成2 對氫鍵，包括羰基上的氧原子和Thr 52 側(cè)鏈的OH 間形成的氫鍵(1.7 ?)以及氰基上的氮原子 與Val 53 間形成的另外一對氫鍵(2.0 ?)。氫鍵網(wǎng)絡(luò)好像“鉗子”一樣，緊緊地將高效氯氟氰菊酯固定在CpGST1 的活性區(qū)域。與高效氯氟氰菊酯不同的是，甲基毒死蜱僅結(jié)合于活性位點(diǎn)中的G亞位點(diǎn)。甲基毒死蜱的三氯吡啶基團(tuán)與Thr 52 具有極性作用;磷酸基團(tuán)上的氧原子與Ser 66 上的NH 形成了一對氫鍵(1.9 ?)，但帶負(fù)電荷的Glu 65殘基通過靜電排斥，使得磷酸基團(tuán)與該氨基酸殘基保持一定的距離(圖2)。靜電排斥作用降低了甲基毒死蜱與CpGST1 的結(jié)合能力，加之甲基毒死蜱-CpGST1 復(fù)合物中只存在一對氫鍵，這就使得甲基毒死蜱與CpGST1 很難形成一個相對穩(wěn)定的復(fù)合體。結(jié)合自由能計(jì)算表明，CpGST1-高效氯氟氰菊酯復(fù)合物的穩(wěn)定性明顯強(qiáng)于CpGST1-甲基毒死蜱，其結(jié)合自由能ΔGbind分別為-28.26 和-16.08 kJ·mol-1(楊雪清，2014;Liu et al.，2014)。

3.2 在蘋果蠹蛾CarE 代謝殺蟲劑分子機(jī)制研究中的應(yīng)用

CarE 是昆蟲體內(nèi)含量最豐富的蛋白之一，此類蛋白與含羧酸酯、酰胺酯、硫酸酯等基團(tuán)的內(nèi)源或外源物質(zhì)的代謝有關(guān)(Birner-Gruenberger et al.，2012)，還與昆蟲的生長發(fā)育、生殖等重要行為有關(guān)(李永強(qiáng)，2012)。

為從結(jié)構(gòu)上研究CarE 與殺蟲劑的相互作用，進(jìn)而揭示CarE 代謝殺蟲劑的分子機(jī)制，Jackson et al.(2013)解析了銅綠蠅Lucilia cuprina (Wied.)羧酸酯酶LcαE7 的晶體結(jié)構(gòu)，這為利用同源模建等分子模擬技術(shù)在其他昆蟲中開展CarE 代謝含酯類鍵化合物的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。但在此之前，CarE 晶體結(jié)構(gòu)在昆蟲中尚未見報道。

Yang et al.(2014)利用同源模建，選擇了與CpCE-1 氨基酸序列一致性高達(dá)38%的黑曲霉Aspergillus niger EstA(PDB: 1ukc: A)為模板，構(gòu)建了CpCE-1 的三維模型;在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分子對接、分子動力學(xué)模擬和計(jì)算丙氨酸掃描。研究表明，CpCE-1(GenBank 登錄號:KC832922)中Asn 233 殘基在CpCE-1 與乙酰甲胺磷作用中的能量貢獻(xiàn)近乎于熱點(diǎn)“Hot-spot”(Moreira et al.，2007)，突變?yōu)楸彼酇la 后，模擬的結(jié)合自由能差值ΔGbind為3.66 kcal·mol-1;乙酰甲胺磷對野生型CpCE-1 的抑制中濃度IC50值為42.18 μmol·L-1，而對N232A 突變體的IC50值高于10000 μmol·L-1;計(jì)算得到的N232A 結(jié)合自由能差值ΔGbind為3.17 kcal·mol-1，與計(jì)算機(jī)模擬值接近;代謝試驗(yàn)表明野生型CpCE-1能夠代謝乙酰甲胺磷，而N232A 不能代謝乙酰甲胺磷，表明Asn 232 是與乙酰甲胺磷結(jié)合和代謝的關(guān)鍵氨基酸殘基。N232A 突變后，“煙斗狀”的活性口袋基本構(gòu)象并沒有發(fā)生明顯的改變，蛋白的正確折疊也沒有受到影響，說明N232A 突變對酶活性無影響，但N232A 突變使得CpCE-1 產(chǎn)生了一個向里延伸的空洞(圖3)，這或許是N232A 突變體難以結(jié)合和代謝乙酰甲胺磷的原因。

在其他昆蟲中，CarE發(fā)生A/G137D 和W251L/S(A/G137 和W251 分別對應(yīng)CpCE-1 中的A121 和W233)突變是昆蟲對有機(jī)磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性的普遍機(jī)制(Cui et al.，2011;Newcomb et al.，1997)，而這個與乙酰甲胺磷結(jié)合和代謝的關(guān)鍵氨基酸Asn 232 殘基在其他抗性昆蟲種群中均未被報道。通過對采自甘肅武威、法國、德國卡爾斯魯厄、瑞士庫爾、澳大利亞、白俄羅斯明斯克、意大利莫利塞7 個地理種群的蘋果蠹蛾成蟲樣本的CpCE-1 基因第122、232、233 位氨基酸殘基進(jìn)行突變檢測，結(jié)果表明，233 位點(diǎn)發(fā)生N232T 和N232A 的頻率分別為20%和30%(Yang et al.，2014)，表明Asn 232與乙酰甲胺磷的代謝密切相關(guān)，而該位點(diǎn)發(fā)生突變可能與蘋果蠹蛾對乙酰甲胺磷潛在抗性的形成有關(guān)(劉吉元，2014;楊雪清，2014)。

圖2 3 個分子與CpGST1 結(jié)合位點(diǎn)示意圖(引自Liu et al.，2014)Fig.2 The schematic representation of the CpGST1 3D model around all of the substrates' binding site(quoted from Liu et al.，2014)

有關(guān)蘋果蠹蛾代謝殺蟲劑分子機(jī)制的研究相對較少。除上述研究外，Yang et al.(2013)還克隆了一個蘋果蠹蛾P(guān)450 基因CYP9A61，并對其時空表達(dá)模式和殺蟲劑誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，CYP9A61 可能與高效氯氟氰菊酯的代謝相關(guān)(Yang et al.，2013);啶蟲脒對蘋果蠹蛾3 齡幼蟲有較好的胃毒活性，其IC50值為3.16 mg·L-1，但亞致死劑量的啶蟲脒對解毒酶CYP9A61、CpGST1 及CpCE-1 基因表達(dá)量無明顯影響(Yang et al.，2015);亞致死劑量的乙基毒死蜱和高效氯氟氰菊酯能顯著誘導(dǎo)蘋果蠹蛾CpCE-1 基因表達(dá)上調(diào)，并抑制異源表達(dá)的CpCE-1 蛋白羧酸酯酶活性(Yang，2015)。為進(jìn)一步闡述解毒酶基因在殺蟲劑代謝和潛在抗性形成方面的作用，分子模擬是闡釋解毒酶與殺蟲劑相互作用的強(qiáng)有力的方法。上述研究表明，分子模擬與生物學(xué)試驗(yàn)相結(jié)合是研究昆蟲解毒酶與殺蟲劑相互作用的可靠方法，為深入研究昆蟲解毒酶對殺蟲劑代謝分子機(jī)制提供了理論保障。

圖3 抗原表位圖(引自Yang et al.，2014)Fig.3 Cavity depth potential surface of the wild CpCE-1 and N232A (quoted from Yang et al.，2014)

4 展望

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、量子化學(xué)和統(tǒng)計(jì)力學(xué)的發(fā)展，分子模擬技術(shù)在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究方面的應(yīng)用將越來越廣泛。僅靠傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法難以揭示所研究的科學(xué)問題的機(jī)制，聯(lián)合分子模擬和其他方法已成為現(xiàn)今研究的主流。當(dāng)然，基于蛋白質(zhì)序列的分子模擬，可能忽視了活體細(xì)胞中的修飾對其構(gòu)型的影響，使得結(jié)果不夠可靠。隨著相關(guān)理論和技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，分子模擬的準(zhǔn)確度越來越高，已成為蛋白質(zhì)功能研究中強(qiáng)有力的工具。分子模擬技術(shù)應(yīng)用最廣、最有發(fā)展前景的領(lǐng)域是藥物開發(fā)和設(shè)計(jì)。雖然目前分子模擬技術(shù)在昆蟲學(xué)研究中的應(yīng)用尚處在起步階段，但隨著人們對分子模擬技術(shù)認(rèn)識的逐步深入，以及對利用計(jì)算機(jī)科學(xué)、生物信息學(xué)、統(tǒng)計(jì)力學(xué)等多學(xué)科聯(lián)合探究生物學(xué)問題的意識的增強(qiáng)，分子模擬將在蘋果蠹蛾等昆蟲代謝殺蟲劑分子機(jī)制研究中，以及抗性機(jī)制的闡釋和基于受體結(jié)構(gòu)的新殺蟲劑的設(shè)計(jì)、具有殺蟲劑殘留去除功能的昆蟲源工程菌的開發(fā)等方面研究中發(fā)揮巨大作用。

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