五味子甲素對(duì)糞腸球菌毒力因子作用的初步研究

崔 紅, 許 穎, 吳 清

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院, 黑龍江 佳木斯 154007)

五味子甲素對(duì)糞腸球菌毒力因子作用的初步研究

崔 紅, 許 穎, 吳 清

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院, 黑龍江 佳木斯 154007)

目的: 研究五味子甲素對(duì)糞腸球菌生物膜的抑菌效果及其對(duì)某些毒力因子表達(dá)的影響。方法： 體外建立糞腸球菌生物膜模型，分別與31.25、62.5、125、250、500 μg/mL五味子甲素、僅含菌液不含藥物的BHI培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)、僅含BHI液體培養(yǎng)基的空白對(duì)照組共同培養(yǎng)12 h后，MTT法檢測(cè)各組抑菌效果；根據(jù)抑菌效果選取適宜藥物濃度(125、250、500 μg/mL)與糞腸球菌共同培養(yǎng)24 h后，RT- PCR法檢測(cè)各組糞腸球菌毒力因子srtC、esp、ebpR mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：五味子甲素對(duì)糞腸球菌生物膜的抑菌作用隨藥物濃度的增加而升高(P<0.05)，其中以500 μg/mL組的抑菌效果最好； 125、250、500 μg/mL的五味子甲素均能明顯抑制srtC、esp、ebpR各毒力因子mRNA的表達(dá)，且其抑制程度均隨著藥物濃度的增加而增加(P<0.05)，當(dāng)藥物濃度為500 μg/mL時(shí)，可完全抑制srtC、ebpR mRNA的表達(dá)。結(jié)論：一定濃度的五味子甲素不僅能抑制生物膜狀態(tài)的糞腸球菌，同時(shí)還能抑制其毒力因子srtC、esp、ebpR的表達(dá)。

五味子甲素; 糞腸球菌; 生物膜; 毒力因子; RT- PCR

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.01.005

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(1): 24]

牙髓病和根尖周病是口腔常見的細(xì)菌感染性性疾病，其治療方法主要為根管治療術(shù)。近年來(lái)，隨著治療手法和儀器的不斷改進(jìn)，其成功率雖有顯著提高，但仍存在一定的失敗率。研究表明，糞腸球菌是導(dǎo)致根管治療失敗的最常見的細(xì)菌之一[1-2]，該菌對(duì)生存環(huán)境的要求較低，能在缺氧、饑餓等惡劣環(huán)境下長(zhǎng)期存活并形成生物膜；形成生物膜后其耐藥性和治療難度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離菌,很難用傳統(tǒng)的治療方法將其清除。因此，關(guān)于糞腸球菌導(dǎo)致根管治療失敗所起的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。加之目前臨床上常用的根管消毒藥物對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的清除效果不佳；甚至有些藥物還存在一定的毒副作用，或使糞腸球菌產(chǎn)生耐藥性，故多數(shù)學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向毒副作用相對(duì)較小且不易產(chǎn)生耐藥性的中藥。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察五味子甲素對(duì)糞腸球菌生物膜的抑菌效果并探討其對(duì)糞腸球菌毒力因子srtC、esp、ebpR轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC(南京便診生物科技有限公司)；五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)品(上海金穗生物科技有限公司，產(chǎn)品批號(hào)20140109，HPLC≥98%)；腦心浸液肉湯(BHI)、瓊脂培養(yǎng)基( 青島海博生物科技有限公司)；噻唑藍(lán)MTT、二甲基亞砜DMSO(廣州寶態(tài)克生物科技有限公司)；RNA 提取試劑、PCR反應(yīng)試劑和DNA Marker( 大連寶生物工程有限公司)；引物( 上海生工生物工程有限公司)；電子分析天平( 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus,日本)；Biometra PCR儀(BIOME-TRA，德國(guó))；TGL- 20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；SMART SPECTMPLUS 超微量分光光度計(jì)(美國(guó))；Tanon2500R數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

將凍存的糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株接種于BHI液體培養(yǎng)基，置于搖床上37 ℃厭氧條件下復(fù)蘇培養(yǎng)24 h。取復(fù)蘇后的糞腸球菌接種于BHI固體培養(yǎng)基并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧條件下培養(yǎng)24 h后，再將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于BHI液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；然后用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲凭鷳乙海⒄{(diào)整細(xì)菌濃度為0.5 McFarland( 1×108/mL)備用。

1.2.2 含藥培養(yǎng)基的制備

取五味子甲素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醛溶液配制成1 mg/mL 的母液，過(guò)濾后再用BHI肉湯培養(yǎng)基依據(jù)二倍稀釋法將母液稀釋成濃度依次為：500、250、125、62.5、31.25 μg/mL的含藥培養(yǎng)基備用。

1.2.3 不同濃度五味子甲素對(duì)糞腸球菌的抗菌作用觀察

取滅菌后的96孔板，分別在每孔中各加入50 μL 糞腸球菌菌懸液和150 μL BHI培養(yǎng)基，封口膜封口后置于37 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h。抽樣檢測(cè)(激光共聚焦顯微鏡觀察)確定生物膜模型建立成功后，棄原培養(yǎng)液，并將其隨機(jī)分為7組(5個(gè)實(shí)驗(yàn)組、1個(gè)陰性對(duì)照組和1個(gè)空白對(duì)照組)；5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入含五味子甲素濃度為500、250、125、61.25、31.25 μg/mL的 BHI培養(yǎng)基各100 μL，陰性對(duì)照組加入僅含菌液不含藥物的BHI培養(yǎng)基100 μL，空白對(duì)照組加入不含菌液和藥物的BHI培養(yǎng)基100 μL，一并置37 ℃厭氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后分別取各組標(biāo)本，用PBS溶液沖洗2～3次后，每孔加入5 mg/mL 的MTT各 20 μL，37 ℃避光孵育4 h;PBS 沖洗2～3次后再于每孔中各加入150 μL DMSO溶液，并置于搖床上震蕩15 min；待結(jié)晶充分溶解后,用全自動(dòng)酶標(biāo)儀分別檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)處的吸光值(A490)，并按以下公式計(jì)算各組的抑菌率(%)。

1.2.4 不同濃度五味子甲素對(duì)糞腸球菌毒力因子表達(dá)影響的觀察

1.2.4.1 分組處理和PCR擴(kuò)增

取糞腸球菌菌液分別接種于含五味子甲素濃度為500、250 、125 μg/mL和0 μg/mL(陰性對(duì)照組)的BHI培養(yǎng)基，置于37 ℃ 厭氧條件下培養(yǎng) 24 h后，分別從每組中各取1 mL培養(yǎng)液按 RNAiso TM Plus(Total RNA 提取試劑)說(shuō)明提取其總RNA；并用RNA PCRkit(AMV)Ver 3.0試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。然后用3對(duì)相應(yīng)引物(上海生工設(shè)計(jì)合成,具體序列見表1)用Biometra PCR儀并按PCR反應(yīng)試劑盒說(shuō)明對(duì)糞腸球菌毒力因子srtC、esp、ebpR 基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR 引物序列

1.2.4.2 瓊脂糖凝膠電泳及分析

取0.3 g瓊脂糖與25 mL 1×TBE電泳緩沖液混合，加熱制成凝膠后，再加入0.2 μL EB混勻并將其倒入凝膠板中凝固15 min備用。取10 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物與2 μL 6×Loading buffer混勻后，置于瓊脂糖凝膠小孔中，于110 v、25 min條件下跑電泳。電泳結(jié)束后將凝膠板置于凝膠成像儀UVI下進(jìn)行觀察；采用Taona 2500 R凝膠圖像處理軟件測(cè)量各電泳條帶的吸光度值，并分析各目的基因的相對(duì)表達(dá)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度五味子甲素對(duì)糞腸球菌的抑制率

不同濃度五味子甲素作用糞腸球菌12 h后，MTT法檢測(cè)各組的吸光值并計(jì)算其抑菌率，結(jié)果顯示：31.25～500 μg/mL五味子甲素對(duì)糞腸球菌均有一定的抑制作用，各濃度組的抑菌率分別與陰性對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中以31.25 μg/mL組的抑菌率最低，但隨著藥物濃度的增加，其抑菌率逐漸增高，各藥物濃度組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組A值及抑菌率比較

不同字母組間P<0.05

2.2 五味子甲素對(duì) srtC、esp、ebpR表達(dá)水平的影響

糞腸球菌菌懸液分別與 500、250、125、0 μg/mL(陰性對(duì)照組) 五味子甲素共同培養(yǎng)24 h后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示：①陰性對(duì)照組和藥物濃度為 125 μg/mL時(shí)，3種毒力因子的條帶均比較清晰；②隨著藥物濃度的增加，各毒力因子的條帶亮度均逐漸變淡，當(dāng)藥物濃度為500 μg/mL時(shí)， srtC 和 ebpR 條帶消失，而esp條帶只是變淡并沒有消失(圖1)。利用凝膠圖像系統(tǒng)處理軟件對(duì)各電泳條帶進(jìn)行定量分析顯示：各濃度藥物組的srtC、esp、ebpR mRNA表達(dá)水平均明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，其降低程度均隨著藥物濃度的增加而增加，各濃度組間兩兩相比均P<0.05(表3)。以上結(jié)果說(shuō)明，125～500 μg/mL不同濃度五味甲素對(duì)糞腸球菌的3種毒力因子srtC、esp、ebpR 的表達(dá)均有不同程度的干擾或抑制作用，當(dāng)其濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí)，可完全抑制srtC和ebpR mRNA的表達(dá)，但不能完全抑制esp mRNA的表達(dá)。

1～4為srtC；5～8為esp；9～12 ebpR；各基因的序號(hào)分別代表不同藥物濃度，從小到大依次為0、125、250、500 μg/mL

圖1 各組srtC、esp、ebpR的PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

同一種基因不同藥物濃度組間兩兩相比，不同字母組間P<0.05

3 討論

五味子甲素是木蘭科(Magnoliaceae)植物五味子的干燥成熟果實(shí)的主要有效成分之一，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等作用[3]。研究表明五味子對(duì)糞腸球菌有一定的抑制作用[4]，故本實(shí)驗(yàn)以五味子的有效成分五味子甲素為對(duì)象，觀察其是否也具有抑制糞腸球菌的作用。結(jié)果顯示，31.25～500 μg/mL不同濃度五味子甲素作用于糞腸球菌生物膜后，其抑菌率隨著藥物濃度的增加而增高，當(dāng)藥物濃度為500 μg/mL時(shí)，抑菌效果最明顯。

糞腸球菌是繼發(fā)性根管內(nèi)感染的主要致病菌，與初次感染的根管相比，其數(shù)量增多，且大部分細(xì)菌已形成生物膜，從而導(dǎo)致其具有極強(qiáng)耐藥性，使治療變得非常困難。有研究認(rèn)為，糞腸球菌在根管內(nèi)形成生物膜與其以下3種毒力因子有關(guān)：①分選酶sortase，該酶是一組介導(dǎo)細(xì)菌表面蛋白與G+細(xì)菌細(xì)胞壁共價(jià)結(jié)合的蛋白酶，是細(xì)菌粘附并發(fā)揮毒力作用的關(guān)鍵因子，根據(jù)其識(shí)別表面蛋白序列的不同，可分為 A、B、C、D等多種[5]，其中srtA 在細(xì)菌錨定到菌細(xì)胞表面的過(guò)程中發(fā)揮重要作用；srtC是糞腸球菌生成菌毛、形成生物膜和誘導(dǎo)心內(nèi)膜炎發(fā)生的重要因子，當(dāng)srtA 基因缺失時(shí)，srtC和(或)其錨定的蛋白可以補(bǔ)償srtA 的部分功能[6]；②esp編碼的腸球菌表面蛋白，該蛋白是類腸球菌細(xì)胞壁上相對(duì)分子量較大的一種表面蛋白(1 873個(gè)氨基酸)[7],由其具有介導(dǎo)細(xì)菌粘附的作用,在糞腸球菌生物膜的研究中逐漸受到重視[7-8]； ③ebp，ebp基因座可影響菌毛形成[9]，其中ebpR是ebpABC的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，ebpABC作為糞腸球菌菌毛相關(guān)操縱子，普遍存在于糞腸球菌分離株中，與其菌毛的生成和生物膜形成有關(guān)[8]。

為進(jìn)一步探討五味子甲素對(duì)糞腸球菌的抑制作用是否通過(guò)影響其相關(guān)毒力因子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，本實(shí)驗(yàn)選取與糞腸球菌形成生物膜有一定關(guān)系的3種毒力因子(srtC、esp、ebpR)為對(duì)象，觀察其在不同濃度五味子甲素作用下的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，125～500 μg/mL不同濃度五味子甲素對(duì)糞腸球菌的3種毒力因子srtC、esp、ebpR mRNA的表達(dá)均有不同程度的干擾或抑制作用，當(dāng)藥物濃度達(dá)到500 μg/mL時(shí)，可完全抑制srtC和ebpR mRNA的表達(dá)，但不能完全抑制esp mRNA的表達(dá)。提示，五味子甲素對(duì)糞腸球菌生物膜及其生物膜形成相關(guān)毒力因子均有明顯的抑制作用。

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The effects of Schisandrin A on the virulence factors ofenterococcusfaecalis

CUI Hong, XU Ying, WU Qing

(SchoolofStomatology,JiamusiUniversity,Jiamusi154007,China)

AIM: To investigate the antibacterial effect of schisandrin A onEnterococcusfaecalisbiofilm and on the expression of the virulence factors. METHODS:Enterococcusfaecalisbiofilm was cultured in vitro. TheEnterococcusfaecalisbiofilm was co- cultured with schisandrin A at 31.25,62.5,125,250 and 500 μg/mL respectively for 12 h, MTT assay was conducted to determine the viable ofEnterococcusfaecalisin the biofilm.Enterococcusfaecalisbiofilm was co- cultured with schisandrin A at 125,250, and 500 μg/mL for 24 h, then srtC, esp and ebpR mRNA was examined by RT- PCR. RESUITS: Schisandrin A showed a dose- dependent inhibitory effect onEnterococcusfaecaliswiability(P<0.05). The highest inhibition was achieved at 500 μg/mL of schisandrin A. Moreover, schisandrin A decreased srtC,esp and ebpR mRNA in a concentration dependent manner(P<0.05). Schisandrin A at 500 μg/mL completely inhibited the mRNA Expression of srtC,esp,and ebpR. CONCLUSION: Schisandrin A can inhibit the proliferation ofEnterococcusfaecalisand the expression of virulence factors srtC,esp, and ebpR mRNA ofEnterococcusfaecalis.

schisandrin a;Enterococcusfaecalis; biofilm; virulence factor; RT- PCR

2014-07-15;

2014-12-01

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(LM2014_045)

崔紅(1989- )，女，漢族，黑龍江人，碩士生(導(dǎo)師：許穎)

許穎, E-mail: xuyingjiayi@126.com

R780.2

A

1005-2593(2015)01-0024-04