甘露聚糖肽片劑中氨基酸成分HPLC指紋圖譜研究

張軻易，毛跟年，毛瑞娟，呂婧，杜磊

甘露聚糖肽片劑中氨基酸成分HPLC指紋圖譜研究

張軻易，毛跟年*，毛瑞娟，呂婧，杜磊

（陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安710021）

采用HPLC法建立甘露聚糖肽片劑中氨基酸類(lèi)成分的指紋圖譜。選用異硫氰酸苯酯進(jìn)行柱前衍生，色譜柱為DiamonsilC18柱，采用2種流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相A為乙腈-水（80∶20），流動(dòng)相B為0.1 mol/L醋酸鈉-乙腈（93∶7，用乙酸調(diào)pH至6.4）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量10 μL；分析時(shí)間45 min。對(duì)來(lái)自3廠家共10批甘露聚糖肽片劑建立了氨基酸成分的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD均不大于3%，未水解甘露聚糖肽片劑指紋圖譜共有峰9個(gè)，水解后共有峰9個(gè)，且水解后樣品色譜圖與對(duì)照色譜圖之間的相似度相差不大均在0.938以上。研究結(jié)果表明，所用方法準(zhǔn)確可靠，適用于甘露聚糖肽片劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

甘露聚糖肽片劑；氨基酸；高效液相色譜；衍生；指紋圖譜

甘露聚糖肽（mannatide），由我國(guó)學(xué)者首創(chuàng)的一種新型生物反應(yīng)修飾物［1］，曾命名為多抗甲素，2000年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局將其正式更名為甘露聚糖肽［2］。甘露聚糖肽具有增強(qiáng)免疫功能、刺激造血、抑制腫瘤生長(zhǎng)等多種功效，常用于提高機(jī)體免疫力或輔助治療免疫低下、腫瘤等疾?。?-5］。

目前市場(chǎng)上的甘露聚糖肽是從健康人口腔中分離的α-溶血性鏈球菌33#菌株經(jīng)深層培養(yǎng)所制得［6］，現(xiàn)已有在魔芋及食用菌等食品中發(fā)酵法制備甘露聚糖肽的研究報(bào)道［7］，為有效利用魔芋和食用菌資源、擴(kuò)大甘露聚糖肽來(lái)源提供了新途徑。甘露聚糖肽經(jīng)水解后會(huì)產(chǎn)生游離的氨基酸，因此可通過(guò)檢測(cè)氨基酸指紋圖譜來(lái)反映其質(zhì)量，而甘露聚糖肽片指紋圖譜的研究至今少見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法（RPHPLC）［8-10］建立了10批甘露聚糖肽片劑中氨基酸指紋圖譜的測(cè)定方法，可有效表征甘露聚糖肽片劑的質(zhì)量，也可為魔芋及其它食品來(lái)源的甘露聚糖肽的質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 材料

甘露聚糖肽片劑（1～4批號(hào)：120802、120803、120805、120806，來(lái)自成都利爾藥業(yè)有限公司；5～7批號(hào)：121005、121006、121007，來(lái)自四川奧邦藥業(yè)有限公司；8～10批號(hào)：130101、130104、130201，來(lái)自廣東宏遠(yuǎn)集團(tuán)藥業(yè)有限公司）

1.1.2 主要試劑

超純水；三水醋酸鈉、異硫氰酸苯酯、乙酸、鹽酸、苯酚、三乙胺、正己烷均為分析純；乙腈為色譜純。18種氨基酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)140624-200805）。

1.2 儀器及設(shè)備

Waters2487高效液相色譜儀，配有Empower色譜工作站：美國(guó)Waters公司；KQ-250DE型超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；ALC-210.2型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHB-3 pH計(jì)：上海三信儀表廠；DGG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SK-1型快速混勻器：金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 異硫氰酸苯酯衍生化試劑的制備

精密量取1.2 mL異硫氰酸苯酯于100 mL棕色容量瓶中，加入乙腈定容，混勻，即得0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液。量取13.5 mL三乙胺于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，混勻后即得1 mol/L的三乙胺乙腈溶液。將配好的兩種溶液按1∶1比例混勻，即得衍生溶液。

1.3.2 未水解樣品溶液的制備

從甘露聚糖肽片劑中取出6片甘露聚糖肽片劑（5 mg/片），采用均勻取樣法，去除包衣，研成粉末，超聲溶解，過(guò)濾，冷卻，將濾液置于25 mL容量瓶中，超純水定容，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，備用。

1.3.3 水解樣品溶液的制備

精密量取上述樣品3 mL于離心管中，加入含1%苯酚的6 mol/LHCl溶液1 mL，充入氮?dú)?，旋緊蓋子密封，放入110℃干燥箱中水解24 h，取出，放冷，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，備用。

1.3.4 氨基酸對(duì)照品混合溶液的制備

精密稱(chēng)取18種精氨酸對(duì)照品適量，溶解并定容于25 mL容量瓶中，搖勻，即得氨基酸對(duì)照品混合液。

1.3.5 衍生及測(cè)定方法

分別精密稱(chēng)取上述處理后的未水解、水解后樣品300 μL置于2 mL離心管中，分別加入1.3.1配制好的衍生溶液適量，混勻，室溫下放置60 min后，加入適量正己烷，渦旋振蕩2 min，靜置10 min，分別萃取3次，取下層溶液，并用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄45 min的色譜圖。

1.3.6 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：25℃。

流動(dòng)相：A相為乙腈-水（80∶20），B相為0.1 mol/L醋酸鈉-乙腈（93∶7，pH6.4）。

流動(dòng)相的梯度洗脫如表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn)

精密量取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，色譜圖中峰面積和色譜峰保留時(shí)間RSD分別小于2.79%和小于3.0%，結(jié)果表明測(cè)定方法具有良好的精密度。

2.1.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密量取同一個(gè)批次樣品5份，制備成供試液，分別進(jìn)樣10 μL。色譜圖中，未水解供試液的各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積RSD分別小于2.99%和2.39%；水解后供試液的各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積RSD分別小于2.0%和2.15%，表明此方法重現(xiàn)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次樣品，制備水解前后供試品溶液，分別放置0、2、4、6、8、12 h后進(jìn)樣10 μL。色譜圖中，未水解供試液的各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積RSD分別小于3.0%和2.73%；水解后供試液的各主要色譜峰保留時(shí)間和峰面積RSD分別小于3.0%和3.0%，結(jié)果表明供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 氨基酸的對(duì)照品色譜圖

精密量取對(duì)照品溶液，按1.3.6色譜條件，進(jìn)樣10 μL，所得對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 18種氨基酸對(duì)照品混合液色譜圖Fig．1 Chromatogram of 18 amino acid standards solution

2.3 指紋圖譜及其各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)

將10批次水解前后樣品溶液按1.3.4方法進(jìn)行衍生，進(jìn)行色譜分析。不同批次的甘露聚糖肽片劑中氨基酸種類(lèi)基本相同，因此10批次樣品的色譜圖基本一致，各分離峰也基本相同，選3號(hào)未水解樣品和水解后的樣品色譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2 未水解樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of non-hydrolyzed sample

由圖2可以看出，未水解供試品溶液在1.3.6色譜條件下各色譜峰可完全分離，其中特征共有峰9個(gè)（選擇色譜峰占總峰面積0.5%以上的共有峰為特征共有峰）。

圖3 水解后樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of hydrolyzed sample

通過(guò)圖3可以看出，水解后供試品溶液各色譜峰分離效果也良好，其中特征共有峰有9個(gè)。

2.3.1 共有峰的標(biāo)定

由圖1、圖2可見(jiàn)，未水解供試品溶液及水解后供試品溶液都各選取了9個(gè)共有峰（包括參照峰），色譜峰基本一致，根據(jù)氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)結(jié)果及文獻(xiàn)資料確認(rèn)為常見(jiàn)氨基酸。

2.3.2 共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積

以蘇氨酸（Thr）為參照峰，分別計(jì)算10批樣品色譜圖中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積。水解前后供試品色譜圖中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD分別小于3.0%和1.35%，而共有峰相對(duì)峰面積的RSD分別小于2.78%和2.75%。

2.3.3 相似度分析

按1.3.4方法所得圖譜，導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》，數(shù)據(jù)匹配后所得樣品水解前后的指紋圖譜見(jiàn)圖4及圖5，相似度數(shù)據(jù)見(jiàn)表2及表3。

圖4 10批次未水解甘露聚糖肽片劑樣品指紋圖譜Fig.4 Fingerprint of 10 patches of non-hydrolyzed sample

由圖4、5可知，10批次水解前后樣品相應(yīng)的色譜峰大體上重疊，符合匹配要求。說(shuō)明10批甘露聚糖肽片劑的差異較小，質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

圖5 10批次水解后甘露聚糖肽片劑樣品指紋圖譜Fig.5 Fingerprint of 10 patches of hydrolyzed sample

由表2、表3可知，以S3作為對(duì)照模板，10批次水解后樣品的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度均在0.938以上，本次實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量較穩(wěn)定，具有較好的一致性。甘露聚糖肽片劑的未水解樣品相似度在0.738～0.999之間，水解后樣品相似度在0.8～0.998之間，水解前后樣品的色譜圖相似度并非完全在0.9以上，可能與樣品質(zhì)量、不同廠家之間的差異及實(shí)驗(yàn)誤差有關(guān)。

3 結(jié)論

針對(duì)甘露聚糖肽片劑中的氨基酸含量建立了高效液相色譜檢測(cè)方法。在建立的色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，各色譜峰可也得到有效分離。

表2 10批未水解樣品指紋圖譜相似度Table 2 Similarity count of fingerprint of 10 patches of non-hydrolyzed sample

表3 10批水解后樣品指紋圖譜相似度Table 3 10 Similarity count of fingerprint of 10 patches of hydrolyzed sample

在樣品色譜圖中，以蘇氨酸色譜峰為參照，10批甘露聚糖肽片劑水解前后色譜圖中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積的RSD均≤3.0%，說(shuō)明所建立的甘露聚糖肽片劑中氨基酸高效液相色譜測(cè)定方法穩(wěn)定性及重現(xiàn)性良好。

甘露聚糖肽片劑未水解樣品和水解樣品指紋圖譜的特征共有峰均為9個(gè)，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)分別為蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸及賴(lài)氨酸。

通過(guò)所建立的甘露聚糖肽片劑指紋圖譜測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)，10批甘露聚糖肽片劑水解前后氨基酸指紋圖譜的相似度均大于0.90，且水解后氨基酸指紋圖譜的相似度更高，均符合相似度要求。說(shuō)明該指紋圖譜檢測(cè)方法可以對(duì)甘露聚糖肽片劑的質(zhì)量控制提供參考。對(duì)有效開(kāi)發(fā)魔芋食品中的甘露聚糖肽，提高魔芋產(chǎn)品的附加值具有重要意義。

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［2］國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（藥典、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）頒布件［S］. 2000國(guó)藥標(biāo)字XG_056號(hào)

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Determination of Fingerprint in Mannatide Tablets by Derivation HPLC

ZHANG Ke-yi，MAO Gen-nian*，MAO Rui-juan，Lü Jing，DU Lei
（School of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science&Technology，Xi′an 710021，Shaanxi，China）

To set up a fingerprint for amino acid in mannatide tablets by High performance liquid chromatography.The samples were investigated by pre-column derivation with Phenylisothiocyanate. Chromatographic conditions：Separations were performed on a DiamonsilC18 column，Gradient elution was used with two mobile phase.Mobile phase A：acetonitrile-water（80∶20），mobile phase B：0.1mol/L acetateacetonitrile（93∶7，adjust pH to 6.4 with acetic acid）；flow rate：1.0 mL/min；detection wavelength：254 nm；column temperature：25℃；Incoming sample amount：10 μL；time analysis：45 min.The fingerprint of ten samples from different mannatide tablets of three factory was established.The relative standard deviation（RSD）of precision and reproducibility was not more than 3%.There were 9 common peaks in non-hydrolyzed sample of fingerprint，9 common peaks in hydrolyzed sample.There was little difference in the similarity between hydrolyzed sample chromatograms and the standard spectrum（similarity above 0.938）.The result showed that the method is accurate，convenient and the chromatographic fingerprints can be served as a tool for the quality evaluation of mannatide tablets.

mannatide tablets；amino acid；HPLC；derivatization；fingerprint

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.029

2014-05-09

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012JZ3002）

張軻易（1988—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：毛跟年（1962—），男，教授，研究方向：藥物新材料研究與開(kāi)發(fā)。