龍須菜寡糖發(fā)酵液的脫色工藝優(yōu)化

王潤萍，高超，產(chǎn)竹華，曾潤穎，*

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波315211；2.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門361005）

龍須菜寡糖發(fā)酵液的脫色工藝優(yōu)化

王潤萍1，高超2，產(chǎn)竹華2，曾潤穎2，*

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波315211；2.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門361005）

為提高龍須菜寡糖的純度，采用糖用活性炭作為脫色劑對龍須菜發(fā)酵液的脫色條件進行了探索。首先通過單因素試驗考察了脫色時間、溫度、震蕩轉(zhuǎn)速、活性炭用量等條件對龍須菜發(fā)酵液脫色效果的影響。其次通過正交試驗得出，糖用活性炭用量濃度為0.4 g/100 mL，脫色時間30 min，脫色溫度25℃，震蕩速200 r/min等條件下可獲得脫色率85.57%，寡糖回收率92.68%。在脫色率較高的同時保證了寡糖的得率，取得了良好的脫色效果。

寡糖；正交試驗；糖回收率；活性炭；脫色率

寡糖（oligosacharides）根據(jù)其生物學功能不同，可將其分為普通寡糖和功能性寡糖兩大類。普通寡糖可被動物消化吸收，產(chǎn)生能量，如麥芽糖；功能性寡糖可促進腸道有益菌（如雙歧桿菌、乳酸菌）的增殖，有益于人和動物的健康，屬于營養(yǎng)生理活性物質(zhì)［1］。功能性寡糖分子結(jié)構(gòu)多樣具有多種生物活性包括：抗腫瘤作用、降血糖血脂、抗自由基氧化、提高機體免疫力等生物活性；而且在農(nóng)業(yè)方面有抑菌、促進生長活性［2］。

前期從西太平洋“暖池”區(qū)沉積物中分離得到一株可直接降解龍須菜產(chǎn)海藻寡糖的深海菌株Flammeovirga sp.Wpaga001。該菌可在接種量5.0%（體積分數(shù)）、37℃條件下降解3.0%（質(zhì)量分數(shù)）龍須菜，獲得寡糖含量3.83 g/L的發(fā)酵液［3］。層析分析所得寡糖聚合度為2-6的低聚糖，主要為瓊膠二糖、三糖、四糖和六糖組成。水溶性好，有利于吸收，大大提高了其應用價值，是一種新型的海洋功能性寡糖［4］。通過實驗表明該海藻寡糖有多種生理活性，具有抗氧化、清除自由基、促生長、抑菌活性、保鮮活性等［5］，其應用前景廣泛。由于龍須菜藻體含有葉綠素和藻紅素［6-7］，色素的存在使得龍須菜寡糖發(fā)酵液經(jīng)過膜除菌后仍有較深的顏色，影響寡糖的色澤度；同時殘留的色素對寡糖的生物活性功能造成影響，為其進一步利用帶來困難，影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量，因此需要對龍須菜寡糖的發(fā)酵液進行脫色處理。

肖志剛等［8］對果寡糖的活性炭脫色工藝進行了研究，在活性炭用量1.2%，pH4.6，脫色時間40 min，脫色溫度70℃條件下脫色率為96.95%；王成福等［9］通過優(yōu)化顆粒活性炭對木糖液脫色可達到70%的脫色率；郭欣然等［10］對D-核糖的活性炭脫色優(yōu)化得出在pH3.5，溫度為50℃，間歇使用活性炭脫色30 min脫色率達80%以上。目前國內(nèi)對于糖用活性炭進行龍須菜寡糖發(fā)酵液脫色工藝研究甚少。本試驗通過正交試驗優(yōu)化了糖用活性炭對龍須菜發(fā)酵液的脫色條件，綜合考慮脫色率和糖回收率，為龍須菜寡糖這一海洋資源的進一步研究、開發(fā)利用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍須菜寡糖：寧波大學海洋學院實驗室自制；糖用活性炭：廣東達豪精細化學品公司；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SKY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實業(yè)有限公司；Innova-4340培養(yǎng)搖床：英國Innova公司；METTLERAE240電子分析天平：瑞士Mettler公司；Sping-S15 i+純水器：RO-DI公司；磨粉機：廣州旭朗機械設(shè)備有限公司；B.BARU.B發(fā)酵罐型5 L標準發(fā)酵罐：德國貝朗公司；RON-150A電熱鼓風干燥箱：上海三騰有限公司；CHB-202恒溫金屬?。汉贾莶┤沼邢薰尽?/p>

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗

1.3.1.1 時間和活性炭添加量對脫色的影響

各取20 mL的發(fā)酵液，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 g/100 mL活性炭，每組3個平行。30℃、pH自然，100 r/min搖床震蕩脫色，分別在20、40、60、80 min時各取1 mL脫色液，12 000 r/min離心8 min。取上清，分別測脫色液的吸光度，計算脫色率；測還原糖含量，計算脫色液中還原糖回收率。

1.3.1.2 溫度對脫色的影響

各取20mL的發(fā)酵液，加入0.4g/100mL活性炭，pH自然，分別在20、30、40、50、60℃不同溫度下200 r/min振蕩脫色，每組3個平行。30 min各取1 mL脫色液，8 min、12 000 r/min離心取上清。分別測脫色液的吸光度，計算脫色率。測還原糖含量，計算脫色液的還原糖回收率。

1.3.1.3 振蕩轉(zhuǎn)速對脫色的影響

各取20 mL的發(fā)酵液，加入0.4 g/100 mL活性炭，置于30℃搖床中。分別設(shè)置靜置、50、100、150、200 r/min進行脫色，每組各3個平行。30 min各取1 mL脫色液。8 min，12 000 r/min離心，取上清。分別測脫色液的吸光值、計算脫色率，測脫色液中還原糖含量、計算還原糖回收率。

1.3.2 正交試驗優(yōu)化龍須菜寡糖的脫色

分別以脫色率和還原糖的回收率作為考察指標，采用L9（33）正交試驗［11］確定最佳脫色參數(shù)，各因素水平見表1。

表1 正交試驗設(shè)計的因素和水平Table 1 Factors and levels for orthogonal experimental design

1.3.3 還原糖含量的測定

DNS法［12］：寡糖發(fā)酵液與DNS以1/3（v/v）比例混合，在沸水中煮沸15 min，冷卻離心，取上清。分光光度計550 nm處測溶液的吸光值A(chǔ)0。

1.3.4 脫色效果計算

式中：A1為寡糖發(fā)酵液在脫色前的OD420；A2為寡糖發(fā)酵液脫色后的OD420。

還原糖回收率/%=（脫色后寡糖發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度-脫色前寡糖發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度）/脫色前寡糖發(fā)酵中還原糖質(zhì)量濃度×100

2 結(jié)果與討論

2.1 時間和活性炭用量對脫色效果影響

根據(jù)實驗結(jié)果得出最佳脫色時間40 min、活性炭用量0.6 g/100 mL。隨著活性炭用量增加脫色率明顯增加，見表2?；钚蕴坑昧颗c還原糖的剩余量呈負相關(guān)。脫色時間相同，隨著活性炭用量增加，提取液中還原糖回收率減小。當活性炭用量為2 g/100 mL時，還原糖剩余量只有14%～18%，見表3。

脫色時間對于脫色率沒有明顯影響，脫色40 min時糖回收率最高。結(jié)果見表2、表3。

表2 時間和活性炭用量對脫色率影響Table 2 Effect of time and dosage of activated carbon on decoloration rate

表3 活性炭用量和時間對糖回收率影響Table 3 Effect of activated carbon dosage and time on sugar recovery rate

活性炭是一種多孔物質(zhì)，主要靠這些孔吸附糖液色素和其他物質(zhì)?；钚蕴坑昧吭蕉?，吸附能力越強，但活性炭吸附屬于物理過程，其多孔吸附是有一定的飽和量［14-15］，過度增加活性炭用量不僅對脫色沒有明顯的效果，反而增加了生產(chǎn)成本不利于實際生產(chǎn)。其次，活性炭的動態(tài)性物理吸附過程，具有吸附與解吸雙向性，色素和寡糖在活性炭上形成了競爭吸附導致色素解吸。脫色時間太長寡糖會氧化，發(fā)酵液顏色加深使得脫色率和糖回收率均降低［16］。因此，綜合考慮脫色率和糖回收率，盡可能降低生產(chǎn)成本、節(jié)約能量，選取活性炭用量0.6 g/100 mL，脫色時間40 min。

2.2 溫度對脫色效果影響

根據(jù)實驗結(jié)果得出，脫色溫度在20℃～30℃之間時，脫色率增長；在40℃時較低70.30%；40℃～60℃時脫色率基本不變。還原糖的回收率在脫色時間為20℃～30℃之間增長明顯，30℃時糖回收率最高91%。結(jié)果見表4。

表4 溫度對脫色效果的影響Table 4 Effect of temperature on the decolorization

活性炭的物理吸附在低溫下即可達到最大吸附量，但會增加吸附時間。而溫度過高，會造成活性炭吸附和解析的動態(tài)過程，而且由于分子熱運動加快使得寡糖分子吸附在活性炭表面，糖回收率下降［17］。因此，根據(jù)的實際條件并且為了節(jié)約能源，最佳脫色溫度30℃。

2.3 轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液脫色效果影響

根據(jù)實驗結(jié)果，震蕩轉(zhuǎn)速越高脫色率越高，轉(zhuǎn)速200r/min時脫色率最高99.76%，糖回收率較高74.8%。轉(zhuǎn)速為0的情況下，糖回收率最高，但是脫色率最低。因此，選取最佳震蕩轉(zhuǎn)速200 r/min對其他條件進行優(yōu)化。結(jié)果見表5。

表5 震蕩轉(zhuǎn)速對脫色效果的影響Table 5 Effect of shock speed on the decolorization

2.4 脫色率的正交試驗結(jié)果

以脫色率和寡糖回收率為參考指標，采用綜合加權(quán)評分法［18］進行考察，權(quán)重系數(shù)為0.5，分別把兩項中最大的指標定為100分，按綜合評分=（脫色率/79.64%）× 100×0.5+（還原糖剩余率/95.64%）×100×0.5計算。正交試驗結(jié)果見表6，分差分析見表7。

表6 正交試驗脫色率和糖回收率結(jié)果Table 6 Results of decoloration rate and sugar recovery rate by the orthotropic experiment

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance for the results of

根據(jù)實驗結(jié)果表明，影響龍須菜寡糖發(fā)酵液活性炭脫色效果的因素重要性順序為A＞C＞B，即時間＞活性炭用量＞溫度。時間對于活性炭脫色效果影響最大，是整個脫色流程的重要點；其次為活性炭用量，最后是溫度。對各因素進行直觀分析，A因素（時間）：K1＞K3＞K2；B因素（溫度）：K1＞K2＞K3；C因素（活性炭用量）：K2＞K1＞K3。由表7方差分析結(jié)果可見，A因素個水平間的差異有顯著性（P＜0.05）因此，在考慮實際生產(chǎn)成本和脫色效果而確定龍須菜寡糖發(fā)酵活性炭脫色工藝的最佳條件為A1B1C2，即脫色時間30 min，溫度25℃，活性炭用量0.6 g/100 mL。

2.5 優(yōu)化的工藝條件試驗驗證

隨機平行取已制備的發(fā)酵液3份，設(shè)置溫度為25℃，加入活性炭0.4 g/100 mL，脫色30 min，轉(zhuǎn)速200 r/min。計算脫色后龍須菜發(fā)酵液的脫色率和還原糖回收率。在此條件下，發(fā)酵液脫色率為85.57%，還原糖回收率為92.68%。與正交試驗結(jié)果相符，確定該工藝條件合理可行，是最優(yōu)的脫色工藝條件。

3 結(jié)論與討論

糖用活性炭對寡糖液進行脫色，具有成本低、反應條件溫和、不影響產(chǎn)品本身的生物活性等特點［19］，且活性炭安全無毒、可重復利用［20］，適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。本實驗通過單因素試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液脫色率的增加會使得寡糖剩余量減少。因此，只有在保證較高的糖回收率的前提下進行脫色才有意義。通過正交試驗，對龍須菜發(fā)酵液脫色的溫度、時間、活性炭用量等條件進行了優(yōu)化，得出脫色時間30 min，溫度25℃，活性炭用量0.6%的脫色條件，此條件下脫色率高且還原糖損失率小。脫色后的寡糖純度提高，雜質(zhì)對其色澤及生物活性等的影響大為減小，為龍須菜寡糖的進一步工業(yè)化生產(chǎn)提供了支持，增加了龍須菜產(chǎn)業(yè)鏈的附加值。

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Optimization of the Decolorizing Process for Gracilaria lemaneiformis Oligosaccharide

WANG Run-ping1，GAO Chao2，CHAN Zhu-hua2，ZENG Run-ying2，*
（1.Shool of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，Zhejiang，China；2.Third Institute of Oceanography，SOA，Xiamen 361005，F(xiàn)ujian，China）

To improve the oligosaccharide purity from Gracilaria lemaneiformis，the decoloring conditions was studied by carboraffin which was used as the decoloring agent.First，through testing the optimal conditions of fermentation liquid from Gracilaria lemaneiformis，The decolorization time，temperature，agitation speed and activated carbon were investigated.Second，through the orthogonal experiment results，the optimal decoloration conditions were as follows：active carbon 0.4 g/mL，decolorating time 30 min，decolorating temperature 25℃，and agitation speed of 200 r/min.Under this condition，the decoloration rate was 85.57%and the recovery rate of oligosaccharide was 92.68%.We got a good decolorizing result with the higher decoloration rate and the oligosaccharide yield.

oligosaccharides；orthogonaltest；recoveryrateofoligosaccharide；activecarbon；decolorationrate

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.025

2013-12-27

海洋公益性行業(yè)科研專項（201105027）；廈門市科技局項目（3502Z20122010）

王潤萍（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：海洋生物資源利用。