均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化魚(yú)頭多糖提取工藝的研究

陳宏碩，高建勝，柏松，劉曉寧，劉安軍

（1.河北聯(lián)合大學(xué)電氣工程學(xué)院，河北唐山063009；2.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院，河北唐山063009；3.天津科技大學(xué)，天津300457）

均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化魚(yú)頭多糖提取工藝的研究

陳宏碩1，高建勝2，柏松2，劉曉寧3，劉安軍3

（1.河北聯(lián)合大學(xué)電氣工程學(xué)院，河北唐山063009；2.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院，河北唐山063009；3.天津科技大學(xué)，天津300457）

本課題選取淡水魚(yú)鯉魚(yú)魚(yú)頭為實(shí)驗(yàn)材料，用弱堿法提取多糖并運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)其工藝參數(shù)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化分析，確定最佳工藝條件為乙醇濃度75%，料液比1∶5.5，提取時(shí)間13 h；DEAE Sephadex A-25柱純化魚(yú)頭多糖，通過(guò)紫外全波長(zhǎng)掃描與紅外圖譜定性分析初步確定魚(yú)頭多糖為一種類(lèi)似于硫酸軟骨素、通明質(zhì)酸的粘多糖類(lèi)物質(zhì)。

魚(yú)頭多糖；均勻設(shè)計(jì)；提取純化

魚(yú)頭中含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂、?；撬?、硫酸軟骨素等多種可預(yù)防或治療疾病的功能物質(zhì)。研究證實(shí)，日本北海道食品加工中心從大馬哈魚(yú)頭中已成功提取分子量為300道爾頓的純活性肽，并用其制成口服液，此口服液有抑制血壓上升，且能長(zhǎng)期穩(wěn)定血壓的功效。魚(yú)頭骨中含有能促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育的天然優(yōu)質(zhì)鈣和多種微量元素，如各種鯊魚(yú)，安康魚(yú)的魚(yú)頭軟骨中含有的多糖類(lèi)物質(zhì)軟骨素，具有抗動(dòng)脈硬化、冠心病、偏頭痛的作用，現(xiàn)已研制出系列功能性食品［1-3］。本文主要對(duì)魚(yú)頭多糖提取的工藝過(guò)程參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化處理，DEAE Sephadex A-25柱純化魚(yú)頭多糖，通過(guò)紫外全波長(zhǎng)掃描與紅外圖譜定性分析魚(yú)頭多糖，從而為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)魚(yú)頭多糖的功能性食品提供前期理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯉魚(yú)魚(yú)頭：水產(chǎn)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)；氫氧化鈉、乙醇、苯酚、硫酸：北京奧利化學(xué)試劑公司；DEAE-葡聚糖凝膠A-25：上海索萊寶生物科技有限公司；硫酸軟骨素標(biāo)品：美國(guó)sigma公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JM-L50型立式膠體磨：上?？苿跈C(jī)械設(shè)備有限公司；HW·SY21-K4電熱恒溫水浴鍋：北京長(zhǎng)風(fēng)儀器廠；Sp-2120型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；付立葉變換紅外光譜儀：瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 魚(yú)頭多糖的提取工藝研究

魚(yú)頭多糖的提取工藝路線［4-5］：魚(yú)頭用膠體磨磨碎→1%甲醇浸泡24 h，除脂→浸于弱堿性氫氧化鈉溶液，攪拌至充分溶解→離心棄去濾渣，取上清溶液，過(guò)濾得濾液→弱酸滴定至pH=5，產(chǎn)生沉淀→離心除沉淀，得上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（50℃）得濃縮液→濃縮液用savag法除蛋白→乙醇沉淀→離心得產(chǎn)物A→95%的乙醇洗滌除鹽，過(guò)DEAE Sephadex A-25柱洗脫→冷凍干燥得產(chǎn)物B。

1.3.2 魚(yú)頭多糖含量測(cè)定

苯酚—硫酸法：準(zhǔn)確稱(chēng)取葡聚糖20 mg，加蒸餾水定容至500 mL，取8個(gè)干凈的試管分別稱(chēng)取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以蒸餾水定補(bǔ)至2.0 mL，然后加6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，混合均勻后，室溫放置20 min。以蒸餾水做空白，于490 nm測(cè)吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品0.1 g/L的溶液1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法測(cè)吸光度，按下式計(jì)算多糖含量：

多糖含量/%=標(biāo)準(zhǔn)曲線查出的濃度/樣品濃度× 100%

1.3.3 魚(yú)頭多糖的DEAE Sephadex A-25純化

取savag法脫蛋白后的多糖20 mg溶于2 mL水中，上柱。采用梯度洗脫，洗脫液為蒸餾水和NaCl，在梯度洗脫儀中分別用水和1 mol/L的NaCl不斷混合，使NaCl濃度不斷增大，流速10 mL/h，分別收集洗脫液（30 min/管），各管用苯酚-硫酸法測(cè)多糖，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，多糖含量（以A490計(jì)）為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，合并多糖高峰部分，濃縮后透析，凍干。

1.3.4 魚(yú)頭多糖的紫外掃描圖譜分析

根據(jù)紫外掃描原理［6］，因?yàn)楹怂岷偷鞍追謩e在260 nm和280 nm處有吸收。所以就可根據(jù)在260 nm和280 nm處是否有吸收來(lái)證明多糖中是否含有核酸和蛋白，從而能從一定水平上證明多糖的相對(duì)純度。

1.3.5 魚(yú)頭多糖的紅外圖譜分析

參照陳培榕［6］的方法：

1）制樣：壓片，樣品掃描次數(shù)10次，背景掃描次數(shù)10次，分辨率8.00 cm-1

2）實(shí)驗(yàn)步驟：稱(chēng)取100 mg～150 mg干燥的KBr，研磨至均勻粉末裝到模具中，放到壓片機(jī)壓制成透明薄片，該片作為空白片；將1 mg～2 mg試樣與100 mg～150mg干燥的KBr研細(xì)均勻，置于模具中，用5×107Pa～10×107Pa壓力在油壓機(jī)上壓成透明薄片，即可用于紅外光譜測(cè)定。試樣和KBr都應(yīng)經(jīng)干燥處理，研磨到粒度小于2 μm，以免散射光影響，波數(shù)范圍4 000 cm-1～400 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

均勻設(shè)計(jì)是在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上建立的優(yōu)選方法。均勻設(shè)計(jì)選用正交設(shè)計(jì)中的優(yōu)點(diǎn)來(lái)安排試驗(yàn)，試驗(yàn)次數(shù)少，而且可以通過(guò)逐步式線形及非線形回歸分析，將每一水平選出。我們根據(jù)前期試驗(yàn)研究結(jié)果，選定提取用的乙醇濃度、料液比、攪拌時(shí)間作為考察的3個(gè)因素，分別細(xì)分各再取9個(gè)水平，以測(cè)定要提取多糖的含量為指標(biāo)，選用U9（96）均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，以確定出該方法的最優(yōu)最合理的提取條件，均勻設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1、表2、表3、表4。（提取液NaOH濃度為1 mol/L，提取溫度為30℃）

表1 均勻設(shè)計(jì)水平表Table 1 The table level of homogeneous design

表2 U9（96）均勻設(shè)計(jì)表Table 2 The homogeneous design table of U9（96）

表3 U9（96）使用表Table 3 The uniform design table of U9（96）

表4 均勻設(shè)計(jì)因素水平表Table 4 The factor levels table of homogeneous design

圖1 均勻設(shè)計(jì)確定最優(yōu)提取條件的管狀圖Fig.1 The tubular figure of optimum extraction by homogeneous design

從圖1中可以得出以下結(jié)論，提取該物質(zhì)最佳條件為乙醇濃度75%，料液比1∶5.5，提取時(shí)間13 h。按均勻設(shè)計(jì)得到的最佳提取條件進(jìn)行試驗(yàn)，每100 g魚(yú)頭中可提取魚(yú)頭粗多糖達(dá)到131.7 mg。

2.2 魚(yú)頭多糖含量分析

取含0.1 g/L樣品的溶液1 mL，按照1.3.2方法測(cè)定吸光度，然后計(jì)算出多糖含量。單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)定提取物魚(yú)頭粗多糖含量最高56.69%，而提取條件優(yōu)化后結(jié)果顯示提取物魚(yú)頭粗多糖含量為63.17%，多糖含量相比提高了6.48%。

2.3 魚(yú)頭多糖的DEAE Sephadex A-25純化結(jié)果

魚(yú)頭多糖的DEAE Sephadex A-25純化結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 未純化魚(yú)頭多糖過(guò)DEAE Sephadex A-25柱得到的峰值圖Fig.2 The peak figure of unpurified fish head polysaccharides through DEAE Sephadex A-25

由圖2可見(jiàn)，未純化魚(yú)頭多糖過(guò)DEAE Sephadex A-25柱，在第9管附近出現(xiàn)了吸收最大值，因此我們?nèi)〉?、9、10管洗脫液冷凍干燥，得到純化后的魚(yú)頭多糖，用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，測(cè)得魚(yú)頭多糖含量為92.8%。

2.4 魚(yú)頭多糖的定性鑒定

2.4.1 純化魚(yú)頭多糖的紫外全波長(zhǎng)掃描

純化后魚(yú)頭多糖紫外吸收特征曲線見(jiàn)圖3。

圖3 純化后魚(yú)頭多糖紫外吸收特征曲線Fig.3 The characteristic curve of ultraviolet absorption about purified fish head polysaccharides

由圖3分析得出，純化魚(yú)頭多糖經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描后，在260 nm處沒(méi)有出現(xiàn)核酸的特征峰，280 nm處也沒(méi)有出現(xiàn)蛋白的特征峰，結(jié)合測(cè)定的多糖含量92.8%，可以推斷出純化后的魚(yú)頭多糖基本不含蛋白等雜質(zhì)，無(wú)須進(jìn)一步純化，可以用其進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4.2 純化魚(yú)頭多糖紅外光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果

純化魚(yú)頭多糖紅外光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 魚(yú)頭多糖與硫酸軟骨素紅外圖譜對(duì)照?qǐng)DFig.4 The infrared spectrum diagram about fish head polysaccharides and chondroitin sulfate

參照糖類(lèi)化合物的光譜分析［7-8］，從圖4可推斷出：

3 600 cm-1～3 200 cm-1的寬峰為O-H，C-H2，C-H3的伸縮振動(dòng)。

2 934 cm-1處峰為C-H伸縮振動(dòng)，且比較弱，1 409 cm-1處為C-H變角振動(dòng)（通常在1 400～1 500之間）。此三處為一般糖類(lèi)物質(zhì)的特征吸收峰。

1 651 cm-1～1 537 cm-1為C=O和C-N伸縮振動(dòng)及612 cm-1處有吸收峰，表明此糖可能為氨基多糖。

1 080 cm-1左右為O-H和C-O伸縮振動(dòng)。

1 237 cm-1為S=O伸縮振動(dòng)（在硫酸軟骨素中，此峰為強(qiáng)峰，而在我們的提取物魚(yú)頭多糖中，比較弱）。

由此推斷，魚(yú)頭多糖可能同硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸等屬于同一類(lèi)物質(zhì)，即粘多糖。

3 結(jié)論

1）通過(guò)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)最終確定魚(yú)頭多糖的最佳提取工藝參數(shù)，即乙醇濃度75%，料液比1∶5.5，提取時(shí)間13 h；此條件下提取的多糖含量為63.17%，比單因素條件下提取的最高多糖含量相比提高了6.48%。

2）通過(guò)DEAE Sephadex A-25柱純化魚(yú)頭多糖，測(cè)得魚(yú)頭多糖含量92.8%。并利用紫外全波長(zhǎng)掃描及紅外色譜分析對(duì)魚(yú)頭多糖做定性鑒定，初步推斷出魚(yú)頭多糖同硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸等屬于同一類(lèi)物質(zhì)，即粘多糖。

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Study on Extraction Process of The Fish Head Polysaccharides by Homogeneous Design Optimization

CHEN Hong-shuo1，GAO Jian-sheng2，BAI Song2，LIU Xiao-ning3，LIU An-jun3
（1.College of Electrical Engineering，HeBei United University，Tangshan 063009，Hebei，China；2.Jitang College of HeBei United University，Tangshan 063009，Hebei，China；3.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The carp head was selecIed as materials in order to study the extraction process of fish head polysaccharides，and the extraction of weak alkali for fish head polysaccharides was studied in this paper. Through the homogeneous design optimization，the optimum process parameters were extracted for 75%ethanol concentration、1∶5.5 dosage liquor rate and 13 h.The fish head polysaccharides was purified by DEAE Sephadex A-25 chromatographic column.Through the Uv wavelength scanning and the Infrared spectrum analysis，the fish head polysaccharides was were determined as the similar of chondroitin sulfate and hyaluronic acid.

fish head polysaccharides；homogeneous design；extraction and purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.017

2013-11-21

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（Z2014003）

陳宏碩（1981—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：功能性食品及食品檢測(cè)。