羧基功能化超順磁性納米粒子吸附牛血清蛋白的特性

吳志超，陳國，蘇鵬飛

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門361021）

磁性納米材料具有較大的比表面積、較好的生物相容性、易分離、具靶向作用、低成本等優(yōu)點，日益受到科學(xué)界的關(guān)注［1－3］.目前，磁性納米粒子已逐步應(yīng)用于污水處理、酶、細(xì)胞等生物催化劑的固定化、藥物的定向運輸、核磁成像等領(lǐng)域［4－9］.裸露的Fe3O4納米粒子表面基團較少［10］，在固定化酶、細(xì)胞等物質(zhì)時，只能通過簡單的物理吸附，存在吸附量較低、吸附力弱的缺點，不能滿足實際應(yīng)用.對其表面進行修飾，通過表面基團改善粒子表面的帶電荷疏水特性，能更好地滿足固定化蛋白及酶等物質(zhì)的需要［10－11］.表面包裹特殊功能的物質(zhì)是較常見的磁性納米粒子修飾方法［8］，許多學(xué)者對其進行了深入的研究［12－16］.然而，當(dāng)前對表面含羧基的超順磁性納米粒子吸附牛血清白蛋白（BSA）的特性研究較少.本實驗室通過化學(xué)共沉淀法制得Fe3O4粒子，再將其用油酸包裹、KMnO4氧化，制得表面包裹有壬二酸的新型羧基磁性納米粒子，粒徑為10nm 左右，在水中具有很好的分散性能，表面分布有較多的羧基功能基團，在水中電離后表面帶負(fù)電，可跟生物大分子，如蛋白質(zhì)表面的帶正電氨基發(fā)生靜電相互作用［17－18］，進一步研究其吸附性能對它的應(yīng)用顯得格外重要.BSA 作為一種重要的模式蛋白，在科學(xué)研究方面起到重要的作用［19］.研究羧基磁性納米粒子吸附BSA 的性能，對其作為蛋白藥物靶向載體、固定化酶載體和固定化細(xì)胞的研究均具有重要的指導(dǎo)意義.本文對實驗室最新制得的新型羧基功能化磁性納米粒子吸附和解吸附牛血清白蛋白的特性進行研究.

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

1）實驗材料：羧基磁性納米粒子（實驗室自制，粒徑為（10±1）nm，羧基為（600±50）μmol·g－1，等電點PI＝4.3）；氯化鈉（NaCl）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸（H3PO4）、工業(yè)酒精（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%，廣東省汕頭市西隴化工有限公司）；考馬斯亮藍(lán)、牛血清蛋白（分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）.

2）實驗儀器：KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；MODEL828型pH 計（美國奧立龍有限公司）；WFZ2800－D3B型紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；8400S型傅里葉紅外變換儀（日本島津儀器公司）；DTG－60H 型熱重分析儀（日本島津儀器公司）.

1.2 實驗方法

考察時間、BSA 初始質(zhì)量濃度、pH 值、溫度對磁性納米粒子吸附BSA 的影響.

1.2.1 時間 取1.5mL 磁流體（40mg·mL－1）加入1.5mL 的NaCl溶液（90mmol·L－1）中，在超聲波清洗儀振蕩（40kHz，120 W）的條件下，加入3mL BSA 溶液（2mg·mL－1）.在溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150r·min－1的條件下進行吸附實驗，分別于2，4，8，16，24，32，40h取樣，檢測其BSA 的吸附量.

1.2.2 BSA 初始質(zhì)量濃度 取6組1.5mL 磁流體（40mg·mL－1）加入1.5 mL 的NaCl溶液（90 mmol·L－1）中，在超聲波清洗儀振蕩（40kHz，120 W）的條件下，加入3mL質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mg·mL－1的BSA 溶液，在溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150r·min－1條件下，作用4h，取樣檢測其BSA 的吸附量.

1.2.3 pH 值 配制6組1.5mL磁流體（40mg·mL－1），依次加入pH 值分別為3.0，3.6，4.2，4.8，5.4，6.0的1.5mL醋酸鹽緩沖液（0.2mol·L－1），超聲波清洗儀振蕩（40kHz，120 W）的條件下各加入3mL BSA 溶液（4mg·mL－1），在溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為150r·min－1的條件下，作用4h，檢測其BSA 的吸附量.

1.2.4 溫度 取1.5mL 磁流體（40mg·mL－1）和1.5mL 醋酸鹽緩沖液（pH 值為4.2，濃度為0.2 mol·L－1）混合，超聲分散后加入3mL BSA 溶液（4mg·mL－1），在溫度分別為0，25，30，37，45℃，轉(zhuǎn)速為150r·min－1的條件下，作用4h，取1mL反應(yīng)液磁分離，檢測其BSA 的吸附量.

1.3 解吸附的方法

取磁流體（40mg·mL－1）與醋酸鹽緩沖液（pH 值為4.2，0.2mol·L－1）各5mL 混合，超聲分散后，加入10mL BSA 溶液（4mg·mL－1），在溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為150r·min－1的條件下振蕩4h，測上清液中BSA 的質(zhì)量濃度，計算BSA 的吸附量.向離心管中加入2mL NaCl溶液（1mol·L－1），振蕩2 min，靜置10min后，磁分離，測上清液中BSA 的質(zhì)量濃度.分別使用0.2，0.5mol·L－1的磷酸二氫鈉溶液代替2mL濃度為1mol·L－1的NaCl，重復(fù)以上實驗.

1.4 分析方法

1.4.1 BSA 質(zhì)量濃度的測量方法 用去離子水準(zhǔn)確配制1mg·mL－1的BSA 溶液，分別稀釋至20，40，60，80，100，120μg·mL－1，各取1mL不同質(zhì)量濃度的BSA 溶液，加入5mL考馬斯亮藍(lán)溶液，漩渦振蕩器振蕩20s，靜置5min后，在波長595nm 處，用722型可見光分光光度計測其吸光度值，擬合BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線.用考馬斯亮藍(lán)法檢測BSA 的溶液質(zhì)量濃度.

1.4.2 粒子的紅外分析方法 采用KBr壓片法對磁性納米粒子進行紅外分析，取一定量干燥的KBr晶體，在瑪瑙研缽中研磨成很細(xì)的粉末，再加入少量干燥過的樣品，繼續(xù)研磨均勻，然后壓片，用Shimadzu 8400S型傅里葉紅外變換儀掃描.

1.4.3 粒子的熱重分析方法 分別準(zhǔn)確稱取1mg干燥過的，吸附有BSA 的羧基功能化Fe3O4磁性納米粒子與羧基磁性納米粒子樣品，N2氛圍下，以10 ℃·min－1的加熱速度，加熱至1 000 ℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性納米粒子吸附BSA 的分析

2.1.1 紅外分析 為了驗證羧基磁性納米粒子能與BSA 之間發(fā)生相互作用，分別對BSA（a）、羧基磁性納米粒子（b）、吸附BSA 的羧基磁性納米粒子（c）進行紅外光譜分析，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知：b，c紅外波譜圖在579cm－1均有明顯的吸收峰，此為Fe3O4的特征峰.3 480cm－1的強寬峰是－OH 的伸縮振動峰，1 624cm－1是C＝O 的吸收峰，這些峰在b和c上均出現(xiàn)，表明b，c均有羧基功能化的Fe3O4核.在a，c中，在1 412，1 126，893cm－1附近固定有相似峰，表明BSA 已被吸附到羧基磁性納米粒子表面.

2.1.2 熱重分析 進一步研究羧基磁性納米粒子表面吸附BSA 的情況，分別對羧基磁性納米粒子（a）、BSA－磁性納米粒子（b）進行熱重分析，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知：吸附BSA 之后的磁性納米粒子有明顯的4個峰.其中：0～200 ℃失去質(zhì)量的峰主要是由粒子表層水和分子內(nèi)的結(jié)合水的失去引起的；200～300 ℃失去的質(zhì)量主要是由物理吸附的BSA 引起的；300～490 ℃失去的質(zhì)量是共價結(jié)合的BSA 的受熱分解造成的；500～750 ℃失去的質(zhì)量是由內(nèi)層的壬二酸的分解引起的；800 ℃之后粒子質(zhì)量略有增加，是由于熱重分析使用的N2的純度不太高，仍含有少量O2，高溫下將Fe3O4進一步氧化成Fe2O3而引起的.

圖1 幾種物質(zhì)紅外光譜Fig.1 FT－IR spectra of several kinds of materials

圖2 磁性納米粒子的TG 曲線Fig.2 TG curves of carboxyl－functioned and immobilized BSA magnetic nanoparticles

通過比較發(fā)現(xiàn)：羧基功能化磁性納米粒子總計失去的質(zhì)量為11.6%，而固定BSA 的磁性納米粒子其壬二酸失去的質(zhì)量為12.1%，這與羧基磁性納米粒子上的壬二酸含量基本吻合.磁性納米粒子吸附蛋白的量約為其總質(zhì)量的13%，這與下文測定的BSA 的吸附量基本上相符.

2.2 不同條件對磁性納米粒子吸附BSA的影響

2.2.1 時間 時間（t）對磁性納米粒子吸附BSA 過程的影響，如圖3所示.由圖3可知：在前10min，BSA 吸附量（Q）迅速增加，10min后基本達到平衡，之后在40mg·g－1磁性納米粒子上下波動，表明磁性納米粒子吸附BSA 是個快速的過程.這是因為BSA 表面分布有大量的Lys，Arg，His等堿性氨基酸殘基，側(cè)鏈上的氨基與磁性納米粒子表面的羧基產(chǎn)生靜電相互作用.由于磁性納米粒子粒徑小，表面無小孔存在，可迅速完成界面吸附.因此，達到吸附平衡時間較短.該吸附過程滿足Lagergren一級吸附動力學(xué)方程.經(jīng)擬合得吸附動力學(xué)方程，即Q＝－41.045·exp（－t／1.414）＋40.84.式中：Q為吸附容量，mg·g－1；t為吸附時間，s.

圖3 時間對磁性納米粒子吸附BSA 的影響 Fig.3 Magnetic nanoparticles adsorption of BSA effected by time

圖4 BSA 濃度對磁性納米粒子吸附BSA 的影響 Fig.4 Magnetic nanoparticles adsorption of BSA effected by BSA concentration

2.2.2 BSA 初始質(zhì)量濃度 BSA 質(zhì)量濃度（ρ）對磁性納米粒子吸附BSA 過程的影響，如圖4所示.由圖4可知：隨著BSA 初始質(zhì)量濃度的增加，吸附量（Q）迅速增加.磁性納米粒子表面的羧基可視為活性吸附位點，BSA 在溶液中的質(zhì)量濃度和磁性納米粒子表面的質(zhì)量濃度差是推動BSA 納米粒子表面運動的動力.在BSA 初始質(zhì)量濃度較低時，若溶液與磁性納米粒子表面的BSA 質(zhì)量質(zhì)量濃度達到平衡，無論表面是否還剩余羧基位點，吸附都將停止.隨著BSA 質(zhì)量濃度的增加，磁性納米粒子表面羧基位點都與BSA 作用，當(dāng)BSA 質(zhì)量濃度達到一定值時，即使繼續(xù)增大溶液中BSA 質(zhì)量濃度，吸附量也不再增大.該等溫吸附過程可由Freundlich吸附方程描述，即Q＝kc1／n.式中：Q為吸附容量，mg·g－1；k為常數(shù)，與吸附相互作用、吸附量有關(guān)；c為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg·mL－1；1／n為常數(shù)，反應(yīng)吸附作用的強度.

經(jīng)擬合可得Q＝36.846c0.178.1／n的數(shù)值一般為0～1，其數(shù)值大小表示質(zhì)量濃度對吸附量影響的強弱.1／n越小，吸附性能越好.當(dāng)1／n為0.1～0.5時，易于吸附.實驗擬合得到的1／n數(shù)值為0.178，說明磁性納米粒子對BSA 的吸附能力很強.

2.2.3 pH 值 pH 值是影響磁性納米粒子吸附BSA 過程的一個重要的因素，它不僅在很大程度上決定了磁性納米粒子的分散穩(wěn)定性，也決定了吸附體系中吸附質(zhì)與吸附劑的表面電荷分布，進而對吸附過程造成巨大的影響.pH 值對磁性納米粒子吸附BSA 的影響，如圖5所示.由圖5可知：隨著pH 值的增加，BSA 吸附量（Q）先增大后減小，呈鐘形變化，且吸附量變化明顯.因為在緩沖液的吸附體系中，磁性納米粒子和BSA 帶電情況由pH 值決定.BSA 的等電點約為4.9，當(dāng)pH 值低于4.9時，BSA 帶正電.磁性納米粒子等電點約為4.3［17］，當(dāng)pH 值高于4.3時，BSA 帶負(fù)電.由此可以推斷，其吸附量最大時的pH 值為4.3～4.9.由圖5還可知：當(dāng)pH 值大于4.9時，BSA 的吸附量迅速減少，這是由于pH 值大于4.9時，羧基磁性納米粒子與BSA 帶同種電荷相互排斥；在pH 值低于4.0時，BSA 的吸附量迅速減小，這是由于pH 值低于4.0時，粒子與BSA 均帶正電，且pH 值越小，帶電量越大，斥力也越大.

2.2.4 溫度 當(dāng)溫度（θ）分別為25，30，37，45 ℃時，磁性納米粒子吸附BSA 的情況，如圖6所示.由圖6可知：溫度為25～45 ℃時，其對磁性納米粒子吸附BSA 的影響不大.這是由于羧基磁性納米粒子吸附BSA 不是簡單的物理吸附，而是通過靜電吸附.這種吸附力較大，完全可以忽略分子熱運動對吸附過程的影響.但是，在實際應(yīng)用中溫度可能會對BSA 的活性造成影響.因此，在吸附的過程中，應(yīng)盡量選擇較低的溫度［20］.與此同時，此溫度為大多數(shù)酶類的最佳催化的溫度區(qū)間，說明本粒子適合作為大多數(shù)酶類的固定化載體.

圖5 pH 值對磁性納米粒子吸附BSA 的影響 Fig.5 Magnetic nanoparticles adsorption of BSA effected by pH value

圖6 溫度對磁性納米粒子吸附BSA 的影響Fig.6 Magnetic nanoparticles adsorption of BSA effected by temperature

2.3 解吸附的研究

在不同解吸液中，BSA 的磁性納米粒子解吸1～3 次的情況，如表1所示.解析率（η）定義為解析下來的蛋白占吸附蛋白總量的百分率.由表1可知：NaCl溶液對BSA 的解吸附能力比較弱，而Na2HPO4對BSA 的洗脫效果較明顯，這是因為BSA 被洗脫下來的主要作用力是洗脫溶液的離子強度.離子強度會壓縮帶電顆粒表面的雙電層，降低粒子表面的Zeta電位，從而降低粒子之間的靜電相互作用，使BSA 和磁性納米粒子發(fā)生分離.而溶液的離子強度的大小除了跟溶液的濃度有關(guān)外，還跟溶質(zhì)電離后形成的離子的價態(tài)有關(guān).相同濃度下，NaCl溶液的離子強度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于Na2HPO4溶液的離子強度.同時，PO3－4為負(fù)3價，大于Cl－的負(fù)1價.隨著解吸附次數(shù)的增加，BSA 的解析量明顯增加.但是，隨著解吸附次數(shù)的增加，其解析量增加的大小會逐漸降低［18，21］.這說明磁性納米粒子與BSA 的結(jié)合是比較牢固的，不易受外界影響，以后用于酶固定化的穩(wěn)定性較為優(yōu)良，有利于固定化酶的多次回收利用.

表1 不同鹽對BSA 解吸附Tab.1 Desorption of BSA by different salts

2.4 磁性納米粒子與BSA 相互作用

BSA 與羧基表面功能化的磁性納米粒子之間主要是靜電相互作用.BSA 由607個氨基酸組成，其中，堿性氨基酸有賴氨酸、精氨酸、組氨酸，等電點較高，在中性條件下帶較多正電荷.堿性氨基酸在BSA 中的比例為17%，而酸性較強的谷氨酸與天冬氨酸所占的比例為16.3%.等電點在pH 值為5～7附近的其他氨基酸所占比例為65.7%.同時，羧基超順磁性納米粒子的等電點約為4.3.在高于等電點的pH 值條件下物質(zhì)帶負(fù)電，在低于等電點的pH 值條件下，物質(zhì)帶正電.在中性條件下，堿性氨基酸帶凈正電荷，磁性納米粒子帶凈負(fù)電荷，而其他氨基酸基本上也帶負(fù)電，此時，只有3種堿性氨基酸與粒子發(fā)生靜電相互作用，因此，吸附量較小.當(dāng)pH 值為4.2～4.9時，等電點為5～7附近的氨基酸也可與粒子發(fā)生相互作用，而大部分氨基酸等電點處于此處，因此，吸附量逐步增大.此外，pH 值的變化導(dǎo)致BSA 整體凈電荷的變化對BSA 與磁性納米粒子的相互接近、BSA 構(gòu)象、BSA 與顆粒結(jié)合時的取向，粒子的比表面積等也會對吸附過程產(chǎn)生影響.

3 結(jié)論

1）以BSA 為目標(biāo)蛋白，研究了新型羧基磁性納米粒子對BSA 的吸附情況，考察時間、BSA 質(zhì)量濃度、pH 值、溫度等條件對磁性納米粒子吸附BSA 的影響，并對吸附有BSA 的磁性納米粒子的解吸附情況進行了研究.

2）經(jīng)紅外和熱重結(jié)果分析，磁性納米粒子成功地將BSA 吸附在其表面.磁性納米粒子吸附BSA的最佳條件：BSA 質(zhì)量濃度為2mg·mL－1；磁流體質(zhì)量濃度為10mg·mL－1；溫度為25 ℃；pH 值為4.0～4.5；吸附量最高可達190mg·g－1左右.

3）磁性納米粒子吸附BSA 后，可被Na2HPO4部分洗脫下來，但不能被NaCl洗脫下來，這進一步說明羧基功能化磁性納米粒子與BSA 的相互作用不是簡單的物理吸附，而是包含有靜電相互作用，這保證了此粒子固定化酶的穩(wěn)定性，也保證了日后固定酶重復(fù)操作的穩(wěn)定性，以及定向給藥的藥物緩釋.

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