EGCG聯(lián)合順鉑對(duì)乏氧人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用

李芳 黃瓅 蘇曉麗 胡成平

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 河南鄭州 450052;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 湖南長沙 410008)

以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化學(xué)治療是晚期肺腺癌，尤其是EGFR基因無突變患者的主要治療手段[1]。然而，由于腫瘤細(xì)胞耐藥性的出現(xiàn)及鉑類的副作用致患者無法耐受，需停藥或減量等，常導(dǎo)致化療失敗，產(chǎn)生治療瓶頸。近年來多項(xiàng)研究表明，實(shí)體性腫瘤乏氧微環(huán)境是腫瘤放、化療抵抗的重要因素[2－3]。綠茶是世界上僅次于水的第二大飲料，含有大量的多酚化合物，以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin－3－gallate，EGCG)含量最高。既往研究顯示，常氧條件下EGCG可增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑或多西他賽的化療敏感性[4－5]。但EGCG對(duì)乏氧條件下腫瘤細(xì)胞化療敏感性的影響及其機(jī)制的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)選取人肺腺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，采用氯化鈷(CoCl2)建立A549細(xì)胞體外化學(xué)乏氧模型，觀察EGCG聯(lián)合順鉑對(duì)乏氧人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與細(xì)胞株 人肺腺癌A549細(xì)胞株(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心)，氯化鈷(CoCl2)，EGCG(美國Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司)，熱滅活胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，溴化二甲基噻唑爾本四氮唑(MTT)(美國AMRESLO公司)，二甲基亞砜(DMSO)(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)，AnnexinV－FITC/PI雙染試劑盒、細(xì)胞凋亡－Hoechst染色試劑盒(上海碧云天公司)，注射用順鉑10 mg/瓶(凍干型)(山東齊魯制藥廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 A549細(xì)胞于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司)中培養(yǎng)，80%匯合時(shí)換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使其同步化后，吸棄原培養(yǎng)液，加入含終濃度0、200 μmol/L CoCl2[6]的10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液。其中0 μmol/L CoCl2為常氧組;200 μmol/L CoCl2為乏氧組;200 μmol/L CoCl2乏氧的同時(shí)，加入 EGCG為EGCG組。

1.2.2 MTT檢測(cè)EGCG單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)乏氧A549細(xì)胞生長的抑制作用 A549細(xì)胞生長培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105/ml，接種至96孔培養(yǎng)板上，37℃、飽和濕度、50 ml/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h同步化后，吸棄培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)分為常氧組、乏氧組及EGCG組，培養(yǎng)24 h后，加入順鉑繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 μl DMSO，振蕩10 min后經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國Bio－Rad公司)測(cè)A570值。各組同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔，不接種任何細(xì)胞，余同各組，以上各組細(xì)胞每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。按以下公式分別計(jì)算各組細(xì)胞的抑制率，并利用直線加權(quán)回歸方程計(jì)算A549細(xì)胞EGCG、順鉑的半效抑制濃度(IC50)。A549細(xì)胞存活率 (%)=(OD實(shí)驗(yàn)組－ OD空白調(diào)零孔)/(OD對(duì)照組－OD空白調(diào)零孔)×100%;A549細(xì)胞生長抑制率(%)=1－細(xì)胞存活率(%)。

1.2.3 光鏡下Hoechst染色法觀察EGCG單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)乏氧A549細(xì)胞核形態(tài)的影響 根據(jù)1.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取EGCG最佳干預(yù)濃度。3組A549細(xì)胞分別接種于含載玻片的6孔板中培養(yǎng)24 h后，加入順鉑，使其濃度為0、10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，按照Hoechst細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明，加入0.5 ml Hoechst 33258染液，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察各組A549細(xì)胞核的形態(tài)。

1.2.4 AnnexinV －FITC/PI雙染法檢測(cè) EGCG 單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)乏氧A549細(xì)胞凋亡的影響 A549細(xì)胞生長培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，調(diào)整A549細(xì)胞濃度為2×106/ml。然后，每孔 1.5 ml(3 ×106/孔)接種于 6孔板中，37℃、飽和濕度、50 ml/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使其同步化后，實(shí)驗(yàn)分為常氧組，乏氧組及EGCG組，培養(yǎng)24 h后，加入順鉑，使其濃度為0、10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照 AnnexinV －FITC/PI雙染法使用說明書進(jìn)行操作。AnnexinV－FITC/PI雙染法結(jié)果分析:雙變量流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)的散點(diǎn)圖上的左上象限(R2):標(biāo)記為AnnexinV－FITC(－)/PI(+)，代表損傷細(xì)胞;左下象限(R4):標(biāo)記為Annexin V－FITC(－)/PI(－)，代表存活細(xì)胞;右上象限(R3):標(biāo)記為AnnexinV－FITC(+)/PI(+)，代表晚期凋亡細(xì)胞和或壞死細(xì)胞;右下象限(R5):標(biāo)記為AnnexinV－FITC(+)/PI(－)，代表早期凋亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)錄入SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多個(gè)組之間的均數(shù)比較采用One way ANOVA，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)化學(xué)乏氧條件下EGCG單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞生長抑制的影響 A549細(xì)胞200 μmol/L CoCl2化學(xué)乏氧培養(yǎng)的同時(shí)，加入EGCG，使其終濃度分別為 0、25、50、100、150、200 mg/L，37℃、飽和濕度、50 ml/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，MTT檢測(cè)結(jié)果示:以50 mg/L EGCG為拐點(diǎn)，A549細(xì)胞生長抑制程度呈EGCG濃度依賴性的增加(圖1)。為避免高濃度EGCG引起A549細(xì)胞顯著抑制進(jìn)而影響順鉑IC50的檢測(cè)，下述實(shí)驗(yàn)EGCG組均選擇50 mg/L EGCG為實(shí)驗(yàn)濃度。3組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入順鉑，使其終濃度分別為 0、10、20、40、80、160 μmol/L。培養(yǎng) 24 h后，MTT結(jié)果示常氧組及EGCG組A549細(xì)胞在相同濃度順鉑作用下的抑制率均較乏氧組升高，進(jìn)一步根據(jù)A549細(xì)胞生長抑制率計(jì)算A549細(xì)胞順鉑IC50，結(jié)果示常氧組及EGCG組順鉑IC50均較乏氧組順鉑降低。見表1。

圖1 EGCG對(duì)乏氧人肺A549細(xì)胞生長、增殖的影響

2.2 Hoechst染色法觀察化學(xué)乏氧條件下EGCG單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞核形態(tài)的影響 3組A549細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入順鉑，使其終濃度分別為0、10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，Hoechst染色法觀察A549細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果示0 μmol/L順鉑作用時(shí)，常氧組及乏氧組A549細(xì)胞核呈藍(lán)色，形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)顆粒均勻分布于細(xì)胞核內(nèi)，EGCG組A549細(xì)胞部分細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)固縮、致密濃染;10 μmol/L順鉑作用時(shí)，3組A549細(xì)胞部分細(xì)胞核均成呈亮藍(lán)色，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)固縮、致密濃染，提示為凋亡細(xì)胞(△)，見圖2。

表1 EGCG對(duì)A549細(xì)胞順鉑IC50的影響(±s)

表1 EGCG對(duì)A549細(xì)胞順鉑IC50的影響(±s)

組別A549細(xì)胞生長抑制率順鉑10 μmol/L 順鉑20 μmol/L 順鉑40 μmol/L 順鉑80 μmol/L 順鉑160 μmol/L 順鉑IC50/(μmol/L)常氧組 0.35 ±0.05 0.46 ±0.07 0.62 ±0.04 0.76 ±0.03 0.91 ±0.01 30.97 ±2.86乏氧組 0.17 ±0.11 0.25 ±0.10 0.34 ±0.11 0.48 ±0.13 0.70 ±0.04 107.01 ±10.19 EGCG 組 0.26 ±0.15 0.35 ±0.05 0.48 ±0.08 0.63 ±0.06 0.82 ±0.05 41.28 ±3.85

圖2 EGCG單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞核形態(tài)的影響

2.3 AnnexinV－FITC/PI雙染法檢測(cè)化學(xué)乏氧條件下EGCG單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響3組A549細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入順鉑，使其終濃度分別為 0、10 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，AnnexinV －FITC/PI雙染法檢測(cè)各組A549細(xì)胞的凋亡率(圖3)，結(jié)果示0 μmol/L順鉑作用時(shí)，EGCG組A549細(xì)胞凋亡率較乏氧組及常氧組均升高(P＜0.05);當(dāng)與10 μmol/L順鉑聯(lián)合作用時(shí)，常氧組及EGCG組A549細(xì)胞凋亡率均較乏氧組A549細(xì)胞升高(P＜0.05)。見表2。

圖3 AnnexinV－FITC/PI雙染法檢測(cè)A549細(xì)胞的凋亡率

表2 EGCG單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響(±s)

表2 EGCG單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞凋亡率的影響(±s)

順鉑0 μ 順鉑10 μ項(xiàng)目/%常氧組 137 980±17 161 0.38±0.12 109 873±8 679 15.88±2 mol/L R2+R3+R4+R5 R3+R5/%mol/L R2+R3+R4+R5 R3+R5.31乏氧組 124 407±10 574 0.41±0.14 122 783±11 173 8.12±0.67 EGCG 組 135 671±9 833 3.15± 0.28 117 714±10 142 13.28±0.11

3 討論

實(shí)體性腫瘤如肺癌、肝癌等常呈失控性生長，導(dǎo)致瘤內(nèi)低氧。研究表明幾乎所有的實(shí)體腫瘤中均有乏氧細(xì)胞存在[7]，距離功能性血管100～150 μm處即可發(fā)生[8]，不僅促使腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移[9－10]，而且是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞化、放療耐藥的始動(dòng)因素[2－3]。本實(shí)驗(yàn)選取人肺腺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，采用 CoCl2建立A549細(xì)胞體外化學(xué)乏氧模型，發(fā)現(xiàn)乏氧組A549細(xì)胞凋亡率較常氧組無明顯增加，與Karovic等[11]研究相似，但是其順鉑 IC50較常氧組增高，說明低濃度(≤200 μmol/L)CoCl2化學(xué)乏氧對(duì)細(xì)胞的毒性作用很弱，但可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞順鉑耐藥。

綠茶是我國產(chǎn)量最多的茶類，又稱不發(fā)酵茶。與烏龍茶等發(fā)酵茶相比，綠茶以茶樹新梢作為原料，經(jīng)殺青、揉捻、干燥等工藝制成，較多地保留了新鮮茶葉內(nèi)的天然物質(zhì)如咖啡堿、脂多糖、茶多酚等。EGCG是從綠茶中提取得到的兒茶素類單體，是綠茶提取物中活性成分茶多酚的主要構(gòu)成部分。流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室研究顯示，飲用綠茶或給予EGCG治療能使女性患腫瘤的時(shí)間推遲 7.3 a，男性推遲 3.2 a[12]，并且防止乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[13]。本課題組長期致力于EGCG的防癌機(jī)制研究[14－16]。前期，本課題組顧其華等[14]發(fā)現(xiàn)給予大鼠200 mg/L EGCG可以通過上調(diào)p53及下調(diào)Bcl－2的表達(dá)，明顯降低大鼠3，4－苯并芘肺內(nèi)注射肺癌成瘤率。游佳等[16]發(fā)現(xiàn)EGCG能夠有效糾正非小細(xì)胞肺癌患者淋巴細(xì)胞中Th1/Th2的異常漂移，有助于以細(xì)胞免疫為主的抗腫瘤免疫能力的恢復(fù)。除防癌、抗癌之外，其他學(xué)者發(fā)現(xiàn)常氧條件下EGCG可明顯增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞或耐順鉑A549細(xì)胞對(duì)吉西他濱或順鉑的化療敏感性[4－5]。但是，有關(guān) EGCG能否增加乏氧條件下腫瘤細(xì)胞化療敏感性的研究較少。

為探討EGCG能否增加乏氧條件下A549細(xì)胞順鉑化療敏感性，本實(shí)驗(yàn)于200 μmol/L CoCl2化學(xué)乏氧條件下，給予不同濃度的EGCG或順鉑作用A549細(xì)胞，MTT檢測(cè)結(jié)果示乏氧條件下A549細(xì)胞以50 mg/L EGCG為拐點(diǎn)，呈EGCG濃度依賴性的生長抑制。當(dāng)50 mg/L EGCG與順鉑聯(lián)合后，EGCG組A549細(xì)胞在相同濃度順鉑作用下的存活率及順鉑IC50均較CoCl2組明顯降低，提示EGCG聯(lián)合順鉑能夠增強(qiáng)乏氧條件下A549細(xì)胞的生長抑制作用。順鉑是肺癌及其他實(shí)體瘤如胃癌、乳腺癌等治療中使用最廣泛的鉑類藥物。通過與DNA形成復(fù)合物，抑制DNA復(fù)制，進(jìn)一步通過下調(diào)BCl－2表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。除去抗腫瘤作用以外，順鉑對(duì)人體常造成脫發(fā)，并產(chǎn)生骨髓抑制、消化道反應(yīng)、神經(jīng)毒性等副作用，嚴(yán)重影響患者的心理健康及生活質(zhì)量，甚至危及患者生命安全，由此常導(dǎo)致順鉑臨床治療受限，降低化療有效率及影響患者預(yù)后。本研究通過Hoechst染色，熒光顯微鏡下觀察A549細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG組及各組加入順鉑后，部分A549細(xì)胞核呈亮藍(lán)色，形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)固縮、致密濃染出現(xiàn)，提示乏氧條件下，EGCG及順鉑均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過AnnexinVFITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGCG組單獨(dú)或聯(lián)合順鉑對(duì)化學(xué)乏氧條件下A549細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果示EGCG組凋亡率較乏氧組增加;與順鉑聯(lián)合作用時(shí)，EGCG組A549細(xì)胞凋亡率較乏氧組顯著增加。

綜上所述，本研究給予低劑量的EGCG聯(lián)合順鉑對(duì)乏氧人肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡起促進(jìn)作用。因此，順鉑化療的同時(shí)給予EGCG，不僅能夠增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)于順鉑耐受較差或需減量的患者，通過減少順鉑劑量，降低高劑量順鉑造成的毒性作用，以期增加耐受性和依從性，明顯改善患者的生活質(zhì)量及預(yù)后。

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