法舒地爾對膿毒癥所致急性肺損傷及肺組織中HMGB1表達的影響

趙 振 韋廣粵

1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生院，桂林 541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，桂林 541004

法舒地爾對膿毒癥所致急性肺損傷及肺組織中HMGB1表達的影響

趙 振1韋廣粵2▲

1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生院，桂林 541004；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，桂林 541004

目的觀察法舒地爾對小鼠膿毒癥所致急性肺損傷的影響及其使用與否對肺組織中HMGB1表達量的影響。 方法將48只BALB-C小鼠隨機分為對照組、盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）組、法舒地爾預(yù)處理組，在6、24 h時間點取血、肺泡灌洗液及鼠肺用于結(jié)果分析。 結(jié)果在6、24 h時間點，法舒地爾可以顯著降低CLP所致的小鼠血清中TNF-α及HMGB1和肺泡灌洗液中蛋白濃度的增加。除此之外，法舒地爾預(yù)處理還可以逆轉(zhuǎn)CLP誘導(dǎo)的小鼠肺組織病理形態(tài)改變。同時，法舒地爾能減少CLP所致小鼠肺組織中HMGB1mRNA表達量的增加。結(jié)論法舒地爾能減輕CLP小鼠所致的肺損傷并降低肺組織中HMGB1的表達。

法舒地爾；膿毒癥；急性肺損傷；Rho激酶；HMGB1

革蘭氏陰性菌引起的膿毒癥仍然是導(dǎo)致急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的常見原因之一［1］，其主要機制是細菌內(nèi)毒素釋放進入血液循環(huán)，激活肺的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致肺損傷［2-3］。炎性介質(zhì)的產(chǎn)生在肺損傷的病理生理機制中起重要的作用。法舒地爾作為一種特異的Rho激酶抑制劑，在臨床上主要應(yīng)用于治療腦血管痙攣，改善腦組織微循環(huán)等［4-7］，然而隨著對Rho激酶的進一步研究發(fā)現(xiàn)其是一種參與多種細胞功能的重要分子開關(guān)，并且其抑制劑可減少NF-κB活化，大大減少促炎性細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，從而使TNF-α，IL-1β等細胞因子的表達減少［8-9］。目前對其抗炎作用的研究多集中在炎癥早期。高遷移率族蛋白1（HMGB1）作為一個重要的炎癥介質(zhì)，在內(nèi)毒素血癥晚期被釋放。HMGB1在血清中的水平與膿毒癥患者的死亡率呈正相關(guān)［10］，因此本實驗希望通過探討法舒地爾對膿毒癥肺組織中HMGB1表達的影響，完善法舒地爾治療膿毒癥所致肺損傷可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級BALB-C小鼠，48只，雌雄不拘，體重25～30 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

酶標儀、PCR擴增儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、光學(xué)顯微鏡、鹽酸法舒地爾注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號1106021）、小鼠HMGB1 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）、小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）、TRIzon總RNA提取試劑 （北京康為世紀生物科技有限公司）、RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒（Thermo，美國）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）。

1.3 CLP肺損傷模型制備及分組

48只BALB-C小鼠隨機分為生理鹽水對照組（NS組，n=16）、盲腸結(jié)扎穿刺組（CLP組，n=16）、法舒地爾（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號1106021）預(yù)處理組（FAS組，n=16）。其中按處死時間不同分為NS 6 h組，NS 24 h組；CLP 6 h組，CLP 24 h組；FAS 6 h組，F(xiàn)AS 24 h組6個亞組，每組8只。FAS組在造模前18 h和30min腹腔注射法舒地爾10mg/kg，NS組和CLP組給予等量的生理鹽水。CLP組和FAS組使用水合氯醛麻醉后，腹部備皮，取正中切口，確定盲腸位置后游離周圍血管，盲腸末端1 cm處4號線結(jié)扎盲腸，7號穿刺針在遠心端穿刺，擠出少許糞便后，將盲腸還納腹腔，縫皮。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 小鼠取血處死后，立即開胸，結(jié)扎一側(cè)肺組織，沿主支氣管注入0.7 ml，10%甲醛溶液后結(jié)扎該側(cè)支氣管放入甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織的病理形態(tài)變化。

1.4.2 血清TNF-α、HMGB1檢測 小鼠摘取眼球取血0.8ml，常溫靜置30min～2 h，以3900 r/min離心25min，取上清放置于-20℃冰箱內(nèi)保存，使用ELISA試劑盒測定小鼠血清TNF-α、HMGB1濃度。

1.4.3 肺泡灌洗液總蛋白濃度測定 小鼠處死后，做頸部切口，游離小鼠氣管，以生理鹽水進行灌洗，回收灌洗液，3000 r/min離心25min，離心后取上清液放置于-20℃冰箱內(nèi)保存，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定肺泡灌洗液總蛋白濃度。

1.4.4 肺組織HMGB1 mRNA的表達 無菌取一側(cè)小鼠肺組織，TRIzon法提取細胞總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，β-肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參。小鼠HMGB1引物序列（擴增片段為174 bp）：5'-CGGATGCTTCTGTCAACTTC-3'（前引物）；5'-TGAACTTCTTTTTGGTCTCC-3'（后引物）。小鼠β-actin引物序列（擴增片段為445 bp）：5'-GAGGGAAATC GTGCGTGAC-3'（前引物）；5'-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3'（后引物）。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進行照相并測定光密度值，以目的基因與內(nèi)參光密度值的比值作為基因表達的相對含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物的一般情況

CLP組的小鼠在手術(shù)后活動能力下降明顯、精神萎靡、呼吸急促、厭食；24 h組可出現(xiàn)豎毛、毛發(fā)光澤度下降、眼周分泌物增多、對外界反應(yīng)淡漠。6 h組處死后解剖可見腸管明顯擴張、腸系膜充血。24 h組處死后解剖可見上述表現(xiàn)進一步加劇且可見血性或膿性腹水，帶臭味。肝大明顯。FAS組亦出現(xiàn)上述癥狀，不過較CLP組輕微，其中24 h組改善較明顯。NS組小鼠如常，無相應(yīng)表現(xiàn)。

2.2 肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

光鏡下可見，NS組小鼠肺組織為正常肺組織，結(jié)構(gòu)清晰完整未見水腫，僅可見有少量炎性細胞。CLP組可見肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重，肺泡萎陷，小鼠的肺中有明顯炎癥細胞浸潤，間質(zhì)水腫，血管充血和出血。FAS組中小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，雖也可見肺內(nèi)有炎性細胞浸潤，但較CLP組明顯減輕（圖1）。

圖1 光鏡下5組小鼠肺組織HE染色（×400）

2.3 血清中TNF-α、HMGB1濃度測定結(jié)果

比較各組小鼠血清中的TNF-α水平：除FAS組的24 h時間點外，各組的濃度明顯高于NS組（P＜0.05），法舒地爾預(yù)處理能顯著降低6 h時間點時膿毒癥小鼠血清中的TNF-α水平（P＜0.05），而在24 h時間點時，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。比較各組小鼠血清中的HMGB1水平：各組的濃度均高于NS組（P＜0.05），法舒地爾預(yù)處理能顯著降低24 h時間點時膿毒癥小鼠血清中的HMGB1水平（P＜0.05），而在6 h時間點時，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 各組小鼠血清TNF-α、HMGB-1的表達（pg/m I±s，n=5）

表1 各組小鼠血清TNF-α、HMGB-1的表達（pg/m I±s，n=5）

與同時間點NS組比較，*P＜0.05；與CLP組同時間點比較，#P＜0.05；與同組6 h比較，▲P＜0.05

組別 TNF-α HMGB1 NS組6 h 24 h CLP組6 h 24 h FAS組6 h 24 h 29.47±2.52 30.24±1.20 22.97±3.80 30.66±4.78 48.66±5.16*34.81±4.58*▲38.96±7.63*77.32±15.07*▲38.11±6.71*#30.03±3.90▲29.18±5.66*62.06±11.59*#▲

2.4 小鼠肺泡灌洗液總蛋白濃度測定及肺組織HMGB-1mRNA的表達結(jié)果

比較各組小鼠肺泡灌洗液總蛋白濃度：除FAS組的6 h時間點外，各組的肺泡灌洗液總蛋白濃度明顯高于同時間點的NS組（P＜0.05），法舒地爾預(yù)處理能顯著降低各時間點內(nèi)的肺泡灌洗液中的總蛋白濃度（P＜0.05）（表2）。比較各組小鼠肺組織HMGB1 mRNA的表達：除FAS組的6 h時間點外，各組小鼠肺組織HMGB1 mRNA的表達明顯高于同時間點的NS組（P＜0.05），法舒地爾能顯著降低24 h時間點時膿毒癥小鼠肺組織HMGB1 mRNA的表達（P＜0.05），而在6 h時間點時，這種降低作用不顯著（P= 0.07）（表2、圖2）。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液總蛋白濃度（m g/m I）及肺組織HMGB1 m RNA的光密度比值測定（x±s，n=3）

圖2 5組小鼠肺組織HMGB1的表達情況

3 討論

在CLP術(shù)后，腸道作為膿毒癥的始動器官，在腸道內(nèi)細菌毒素的刺激下通透性增加，細菌本身及其分泌產(chǎn)物大量經(jīng)腸道吸收入血進入血液循環(huán)并分布于機體各主要器官及組織。肺臟由于其雙重血供、血管網(wǎng)密集和大量的肺泡間隙等特殊的解剖組織學(xué)特征致使血液內(nèi)的毒素和炎性細胞大量通過，并容留其中，這些炎性細胞大量釋放各種蛋白酶和炎癥因子，進一步加重肺損傷［11］。

CLP模型肺損傷的嚴重程度與毛細血管滲漏和肺水腫的顯著性相關(guān)［12］。在本實驗中，可通過肺泡灌洗液中蛋白質(zhì)的濃度及其光鏡下的病理改變加以證明，CLP組的小鼠的肺泡灌洗液濃度隨時間的延長而逐漸增高。同樣，在病理切片的觀察中，也可以發(fā)現(xiàn)CLP組小鼠肺中的炎癥細胞浸潤，間質(zhì)水腫，血管充血和出血也隨時間的延長而逐漸增高。Rho和Rho激酶參與中性粒細胞的激活，從而增加內(nèi)皮通透性和細胞因子介導(dǎo)的屏障功能障礙加重，因此法舒地爾作為特異性的Rho激酶抑制劑可預(yù)防中性粒細胞依賴性的氧化-炎癥通路的激活，從而有助于減少液體外滲和組織病理學(xué)的改善［13-14］。研究亦表明，法舒地爾無論在炎癥早期（6 h時間點）還是炎癥中晚期（24 h時間點）均可顯著降低肺泡灌洗液中的蛋白濃度，并使病理切片中的炎癥表現(xiàn)得到較大緩解。

既往認為，早期促炎介質(zhì)（TNF-α、IL-1等）是膿毒癥引起肺損傷時機體失控性炎性反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，然而在臨床中采用TNF-α拮抗劑治療并未取得滿意效果，究其原因，可能是這些早期炎癥因子只在炎癥早期一過性升高，而此時患者可能并未入院治療，而其拮抗劑發(fā)揮作用時，這些因子早已恢復(fù)正常水平［15］。近年來一種“晚期”炎癥介質(zhì)——HMGB1逐漸進入人們的視野，其通常在炎癥發(fā)生的6 h后才開始升高，24 h達到高峰，并長期處于高表達的狀態(tài)，因此成為多種疾病治療的新靶點。與TNF-α相似，在體外實驗中，HMGB1處理過的細胞出現(xiàn)肺臟內(nèi)細胞局部炎癥時的表現(xiàn)，其可通過使血管內(nèi)皮細胞骨架肌動蛋白重構(gòu)而使細胞形態(tài)改變，細胞間隙增加［16］。在本實驗中，采用ELISA檢測各組小鼠血液中早期炎癥因子TNF-α和中晚期炎癥因子HMGB1，結(jié)果顯示，在CLP模型中TNF-α僅在炎癥早期一過性增高，至24 h時間點時其表達明顯下降，而HMGB1在炎癥早期（6 h時間點）開始增加，并在24 h時間點時仍持續(xù)增加。同時，采用PCR的方法檢測各組小鼠肺組織中的HMGB1 mRNA的含量，結(jié)果顯示，CLP模型組的HMGB1mRNA表達量也隨炎癥時間的延長呈持續(xù)增高。有實驗表明，Rho激酶參與多種誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的活化，如NF-κB和AP-1等［17-19］，而這些轉(zhuǎn)錄因子的出現(xiàn)對于轉(zhuǎn)錄一些炎癥基因（TNF-α，HMGB1等）起關(guān)鍵作用［20］，因此本實驗中，F(xiàn)AS各時間組小鼠血液中TNF-α、HMGB1等炎癥因子的表達均低于同時間組的CLP模型組。同理，F(xiàn)AS組小鼠肺組織中的HMGB1 mRNA的含量也低于同時間組的CLP模型組，尤以24 h組明顯。

總之，在采用CLP手術(shù)致小鼠腹部膿毒癥的模型中，可以發(fā)現(xiàn)法舒地爾作為一種特異性的Rho激酶抑制劑使用預(yù)處理的方式能減輕膿毒癥所致的不同時間點的急性肺損傷，減少肺組織的病理改變，其發(fā)揮的抗炎作用可能不僅局限于炎癥的早期階段，也可能通過下調(diào)HMGB1的表達等方式在炎癥的中晚期發(fā)揮作用。

［1］Matthay MA，Zimmerman GA，Esmon C，et al.Future research directions in acute lung injury：summary of a National Heart，Lung，and Blood Institute working group［J］. Am JRespir Crit Care Med，2003，167（7）：1027-1035.

［2］Bhatia M，Moochhala S.Role of inflammatory mediators in the pathophysiology of acute respiratory distress syndrome ［J］.JPathol，2004，202（2）：145-156

［3］Ghosh S，Latimer RD，Gray BM，et al.Endotoxin-induced organ injury［J］.Crit Care Med，1993，21（2 Suppl）：S19-S24.

［4］劉康，丁素菊，吳濤，等.Rho激酶抑制劑對大鼠腦缺血損傷的腦保護作用及S100B蛋白表達的影響［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2011，24（2）：111-113.

［5］吳曉燕.急性腦梗死患者血清CRP、Hcy水平及法舒地爾對其影響［J］.中國社區(qū)醫(yī)師·醫(yī)學(xué)專業(yè)，2011，13（3）：18-19.

［6］Zhao J，Zhou D，Guo J，et al.Efficacy and safety of fasudil in patients with subarachnoid hemorrhage：final results of a randomized trial of fasudil versus nimodipine［J］.Neurol Med Chir（Tokyo），2011，51（10）：679-683.

［7］Zhao J，Zhou D，Guo J，etal.Effectof fasudilhydrochloride，aprotein kinase inhibitor，on cerebralvasospasm and delayed cerebral ischemic symptoms after aneurysmal subarachnoid hemorrhage［J］.NeurolMed Chir（Tokyo），2006，46（9）：421-428.

［8］王海云，盛凈，朱健.法舒地爾對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織中核因子-κB激活的影響［J］.中華實用診斷與治療雜志，2013，27（2）：155-158.

［9］肖雪飛，楊明施，孫圣華.姜黃素對膿毒癥急性肺損傷的炎癥反應(yīng)及NF-κB信號通路的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2013，23（30）：19-22.

［10］Bitto A，Barone M，David A，et al.High mobility group box-1 expression correlates with poor outcome in lung injury patients［J］.Pharmacol Res，2010，61（2）：116-120.

［11］Kutsukake M，Matsutani T，Tamura K，et al.Pioglitazone attenuates lung injury by modulating adipose inflammation［J］.JSurg Res，2014，189（2）：295-303.

［12］Cinel I，Ark M，Dellinger P，et al.Involvement of Rho kinase（ROCK）in sepsis-induced acute lung injury［J］.JThorac Dis，2012，4（1）：30-39.

［13］Gorovoy M，Neamu R，Niu J，etal.RhoGDI-1modulation of the activity ofmonomeric RhoGTPase RhoA regulates endothelialbarrier function inmouse lungs［J］.Circ Res，2007，101（1）：50-58.

［14］Hasan Z，Palani K，Zhang S，et al.Rho kinase regulates induction of T-cell immune dysfunction in ab dominal sepsis［J］.Infect Immun，2013，81（7）：2499-2506.

［15］康華，孫宇，姜虹.氯胺酮對急性肺損傷大鼠肺組織HMGB1表達的影響［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2009，11（7）：1180-1186.

［16］Zheng YJ，Zhou B，Song ZF，et al.Study of Astragalus mongholicus polysaccharides on endothelial cells permeability induced by HMGB1［J］.Carbohydr Polym，2013，92 （1）：934-941.

［17］Ding RY，Zhao DM，Zhang ZD，et al.Pretreatment of Rho kinase inhibitor inhibits systemic inflammation and prevents endotoxin-induced acute lung injury in mice［J］.J Surg Res，2011，171（2）：e209-e214.

［18］Pastor MD，Nogal A，Molina-pinelo S，et al.Identification of proteomic signatures associated with lung cancer and COPD［J］.JProteomics，2013，89：227-237.

［19］楊廷芳，王興勇，胡語航，等.NF-κB和HMGB1在大鼠腸缺血再灌注肺損傷中的表達及白藜蘆醇苷的保護作用［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，34（1）：24-28.

［20］Luo L，Zhang S，Wang Y，et al.Proinflammatory role of neutrophil extracellular traps in abdominal spesis［J］. Physiol Lung Cell，2014，307（7）：586-596.

The influence of fasudil on acute lung injury induced by sePsis and the HMGB1 exPression in lung tissue

ZHAO Zhen1WEIGuang-yue2▲
1.Graduate School，Guilin Medical College，Guilin 541004，China；2.Department of Emergency，Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541004，China

Objective To observe the influence of fasudil on acute lung injury induced by sepsis inmice and the influence of using fasudil or not on the expression quality of HMGB1.Methods 48 BALB-Cmice were randomly divided into the control group，the cecal ligation and puncture（CLP）group，the fasudil preconditioning group.Blood，bronchoalveolar lavage fluid and lung ofmice was taken respectively at 6 and 24 hours time point for the analysis of results.Results At 6 and 24 hours time point，the increased TNF-αand HMGB1 level in serum and protein concentration in bronchoalveolar lavage fluid induced by CLP could be significantly reduced.In addition，pathological changes of lung tissue in mice was reversed by the fasudil preconditioning.At the same time，increased the expression quality of HMGB1 mRNA induced by CLP lung tissue in mice were reduced by fasudil.Conclusion Fasudil can alleviate the lung injury induced by CLP inmice and reduce the expression of HMGB1 of lung tissue.

Fasudil；Spesis；Acute lung injury；Rho kinase；HMGB1

R332

A

1674-4721（2015）02（c）-0004-04

2014-10-09本文編輯：許俊琴）

趙振（1989-），男，2012級在讀碩士研究生，急診醫(yī)學(xué)專業(yè)（重癥方面）

▲通訊作者：韋廣粵（1964-），男，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：呼吸機的臨床應(yīng)用