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    非編碼RNA在鼻咽癌中的表達(dá)研究

    2015-11-15 07:37:38陳明政鄒學(xué)森李金高龔小昌陳文學(xué)
    實用癌癥雜志 2015年12期
    關(guān)鍵詞:鼻咽細(xì)胞株鼻咽癌

    陳明政 鄒學(xué)森 李金高 龔小昌 敖 帆 陳文學(xué)

    從基因組研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)高等動物及人類基因組中編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域只占1%~2%,大多數(shù)區(qū)域不編碼蛋白質(zhì),但是會通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量的非編碼 RNA(noncoding RNA,ncRNA),這些ncRNA沒有開放性讀碼框,或者有一個保守性非常差的短開放性讀碼框。ncRNA分為兩類,一類為長度小于200 nt的RNA分子稱為小分子RNA,包括microRNA和小干擾RNA,另一類為長度大于200 nt的RNA分子稱為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)。近10年的研究發(fā)現(xiàn)大量的小分子RNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)控作用,而對lncRNA的發(fā)現(xiàn)和功能研究比較少,到目前為止只有十幾種lncRNA的功能研究的比較清楚,近期的研究顯示lncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性[1-2]。本研究通過EST數(shù)據(jù)庫搜索和電子差異表達(dá)差減算法等生物學(xué)信息學(xué)方法預(yù)測了5個可能與鼻咽癌相關(guān)的lncRNA,通過熒光定量PCR方法檢測其在細(xì)胞株和鼻咽癌組織表達(dá)量篩選出與鼻咽癌的相關(guān)性lncRNA。

    1 材料與方法

    1.1 組織標(biāo)本收集

    30例組織標(biāo)本均取自江西省腫瘤醫(yī)院放三科鼻咽鏡室,其中初治鼻咽癌患者20例,鼻咽淋巴組織增生標(biāo)本10例,所有的組織標(biāo)本均經(jīng)過病理學(xué)檢查明確診斷。組織標(biāo)本離體后立即放入無RNA酶的凍存管中,浸入液氮中保存。

    1.2 細(xì)胞株

    鼻咽正常細(xì)胞株NP69和鼻咽癌細(xì)胞株HK1由本室保存。培養(yǎng)條件NP69用K-SFM培養(yǎng)基(GIBCO公司),HK1用汗10%滅火胎牛血清的1640培養(yǎng)基(GIBCO 公司),37 ℃,5%CO2培養(yǎng)。

    1.3 方法

    1.3.1 RNA提取和純化及cDNA合成 細(xì)胞株RNA提取參照TRIZOL試劑(Invitrogen)說明書,組織標(biāo)本參照微量RNA提取試劑盒(天根生化)提取。所有提取的RNA都用DnaseⅠ去除總RNA中混雜的基因組DNA污染。提取結(jié)束后用紫外分光光度儀檢測波長260 nm和280 nm下RNA光密度值,計算出RNA純度并定量。采用隨機(jī)引物將純化后的RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

    1.3.2 實時熒光PCR擴(kuò)增 PCR引物序列見表1,按照Sybgreen PCR mix試劑盒(Takala公司)說明書的操作步驟進(jìn)行PCR操作,操作結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。

    1.3.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,K-S檢驗檢測各種數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布,組間比較采用t檢驗,檢驗水準(zhǔn)為P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    表1 PCR引物序列

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)胞株中5個lncRNA的表達(dá)情況

    熒光PCR結(jié)果采用2△△ct方法計算各lncRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示LINC00520在HK-1中呈低表達(dá),MIR100HG、LINC00340、DNM30S、LINC01135 在HK-1中呈高表達(dá)。

    2.2 組織lncRNA中5個的表達(dá)情況

    20例鼻咽癌標(biāo)本中有5例標(biāo)本RNA提取失敗,10例鼻咽良性病變標(biāo)本有2例RNA提取失敗。所有的標(biāo)本用熒光PCR結(jié)果采用2△△ct方法計算各lncRNA的表達(dá)情況。將所有標(biāo)本中的極大值極小值去除,鼻咽癌組和非鼻咽癌組的表達(dá)情況見圖1。通過統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LINC00340、DNM30S在鼻咽癌組表達(dá)水平高于非鼻咽癌組,P值分別為0.014和0.005。LINC00520在非鼻咽癌組表達(dá)高于鼻咽癌組,P值為0.038。

    圖1 lncRNA在鼻咽癌組和非鼻咽癌組中表達(dá)情況

    3 討論

    近幾年對非編碼RNA尤其是microRNA研究非常廣泛,但是對lncRNA研究較少,尤其是在腫瘤研究領(lǐng)域。Baranova首先使用電子差異表達(dá)算法預(yù)測腫瘤特異性ESD片段,后來經(jīng)過對6個沒有編碼蛋白質(zhì)潛能的ESD片段進(jìn)行PCR分析,發(fā)現(xiàn)計算機(jī)預(yù)測和實驗結(jié)果基本上相互吻合[3-4]。因此本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測在鼻咽癌中有差異表達(dá)的lncRNA,通過對5個lncRNA進(jìn)行表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)3個lncRNA在鼻咽癌與非鼻咽癌之間有差異表達(dá)。

    在標(biāo)本RNA的提取過程中如果污染了基因組DNA,在擴(kuò)增過程中將無法區(qū)分?jǐn)U增信號的真實來源,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。本研究在PCR擴(kuò)增過程中采用基因組對照以明確是否有基因組污染導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。lncRNA不同于mRNA,不一定具備多聚A尾,因此我們使用隨機(jī)引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以減小誤差。

    研究顯示lncRNA通過不同的分子機(jī)制起不同的生物學(xué)作用包括遺傳印跡(如H19 RNA)、反式基因調(diào)節(jié)(如HOTAIR)、P53應(yīng)答下調(diào)控全基因抑制活動(如linc RNA-p21)、作用于X染色體失活(如Xist)和調(diào)節(jié)細(xì)胞核輸入(如 Nron)。近期研究顯示,H19和 HOTAIR等一些 linc RNA參與腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)的3個有差異表達(dá)的linc RNA分別為LINC00520、LINC00340、DNM30S。LINC00520 是 2012年新發(fā)現(xiàn)的基因,它與西班牙兒童肥胖有相關(guān)性[7],2014年全基因組研究顯示LINC00520與孟加拉國成年人體重相關(guān)的一個基因表型[8]。LINC00340目前被認(rèn)為是抑癌基因,大部分相關(guān)研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤中有報道,低水平的LINC00340表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)展有高度相關(guān)性,患者預(yù)后更差,基因表達(dá)分析顯示隨著LINC00340表達(dá)的降低,神經(jīng)母細(xì)胞內(nèi)的分子標(biāo)志降低,細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞粘附能力增加[9-10]。DNM30S可以形成mir199A2前體調(diào)節(jié)mir199A2/214表達(dá),在卵巢癌干細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)mir199A2/214可以調(diào)節(jié)卵巢癌干細(xì)胞的分化,原始卵巢癌干細(xì)胞mir199A2/214低表達(dá),成熟的卵巢癌干細(xì)胞mir199A2/214高表達(dá)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)的 3個 linc RNA在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后中起什么樣的作用還有待于后續(xù)的研究。

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