α27基因特異性siRNA對單純皰疹病毒Ⅱ型感染宿主細(xì)胞的影響

楊兆林 陳 茵 汪 莉 趙少鋒邵艷玲

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣佛醫(yī)院廣東省佛山市南海區(qū)第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東佛山528251

α27基因特異性siRNA對單純皰疹病毒Ⅱ型感染宿主細(xì)胞的影響

楊兆林 陳 茵 汪 莉 趙少鋒▲邵艷玲

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣佛醫(yī)院廣東省佛山市南海區(qū)第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東佛山528251

目的探討在RNA干擾技術(shù)條件上，干擾α27基因表達(dá)對單純皰疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）宿主細(xì)胞的影響。方法體外合成四對α27基因特異性siRNA（R1、R2、R3、R4組）和陽性、陰性對照siRNA，用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后接種HSV-Ⅱ，感染后用MTT比色法分別于12、24、36、48、60、72 h測定細(xì)胞的存活情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染了特異性siRNA的細(xì)胞OD值較空白組高，細(xì)胞存活情況較好，其中R2和R4組存活情況更好。結(jié)論α27基因特異性siRNA對宿主細(xì)胞具有保護(hù)作用。按照同樣設(shè)計原則合成的不同序列siRNA，其抑制效果存在明顯差異。

α27基因；siRNA；RNA干擾；單純皰疹病毒Ⅱ型；Vero細(xì)胞

生殖器皰疹（genital herpes，GH）是由單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）感染生殖器和肛門部位皮膚、黏膜而引起的一種慢性、易復(fù)發(fā)的性傳播疾病。GH的病原體90％為HSV-Ⅱ型［1］。HSV-Ⅱ基因組為一線性雙鏈DNA分子，根據(jù)基因表達(dá)時序的不同，分為立即早期、早期、晚期基因，分別稱為α、β、γ基因，分別編碼立即早期蛋白、早期蛋白及晚期蛋白。立即早期基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)在病毒DNA復(fù)制之前，調(diào)節(jié)β、γ基因的表達(dá)。迄今為止，人們已知的HSV編碼的立即早期蛋白有5個，它們被稱為感染細(xì)胞多肽分子（infected cell polypeptides，ICPs），包括ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47［2］。從位置上看，α27基因又稱為UL54，它編碼的ICP27具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，是唯一能在皰疹病毒的每個亞科找到其同源蛋白的α蛋白［3-5］。最近研究發(fā)現(xiàn)，ICP27能夠通過調(diào)節(jié)宿主mRNA的代謝過程，抑制宿主細(xì)胞蛋白的合成，本研究利用RNA干擾技術(shù)，觀察抑制α27基因表達(dá)對HSV-Ⅱ宿主細(xì)胞的影響，為保護(hù)宿主細(xì)胞提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 病毒懸液及細(xì)胞株

所用病毒為臨床株，經(jīng)測定組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（50％tissue culture infective dosage，TCID50）為10-5.166。Vero細(xì)胞株：非洲綠猴腎細(xì)胞，購自中山大學(xué)北校區(qū)動物實驗中心，傳代培養(yǎng)保存。

1.2 siRNA合成

由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司代為設(shè)計合成四對α27基因特異性siRNA（R1、R2、R3、R4組）和陽性對照組、陰性對照組siRNA。陽性對照為文獻(xiàn)報道的針對UL29基因（編碼一種DNA結(jié)合蛋白）有效的siRNA序列［6］。陰性對照和選中的siRNA序列有相同的組成，序列打亂，但是和該基因mRNA沒有同源性。其中：陽性對照組：sense 5′-UU UCG CAA UCA AUU CCA ATT-3′，antisense 5′-UG GAA UUG AUU GCG AAA GTT-3′；陰性對照組：sense 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，antisense 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′；熒光陰性對照：sense 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，antisense 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′；R1組920：sense 5′-CGU CGG GUU UCC UGG GAA ATT-3′，Antisense 5′-UUU CCC AGG AAA CCC GAC GGG-3′；R2組1326：sense 5′-GCG UGU CGG AGA UCG ACU ATT-3′，antisense 5′-UAG UCG AUC UCC GAC ACG CCG-3′；R3組748：sense 5′-GGC GGU UCU GAG AUC CAU ATT-3′，antisense 5′-UAU GGA UCG CAG AAC CGC CCG-3′；R4組1405：sense 5′-GGC GGG UCU CAU UGA AAU ATT-3′，antisense 5′-UAU UUC AAU GAG ACC CGC CAT-3′。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)

Vero細(xì)胞用10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)［7-8］，用胰蛋白酶+EDTA消化后，以0.5×105/ml的密度接種于24孔板中，每孔加入500 μl無抗生素培養(yǎng)基，細(xì)胞長到融合率為50％～60％時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取0.5、1.0、1.2、1.5 μl/孔的Lipofectanmine2000及1.0、1.5、2.0、2.5 μl/孔的FAM-siRNA，進(jìn)行兩兩組合，每種組合種4個復(fù)孔。通過熒光顯微鏡下觀察和流式細(xì)胞儀檢測各種組合轉(zhuǎn)染效率，以最優(yōu)轉(zhuǎn)染效率的組合濃度進(jìn)行下一步轉(zhuǎn)染。

1.4 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合液加入含有細(xì)胞及不含血清的培養(yǎng)液，共6組siRNA（陽性對照組、陰性對照組、R1組920、R2組1405、R3組748、R4組1326）。同時設(shè)空白組，即不加轉(zhuǎn)染試劑及siRNA，同等條件下加入不含血清的培養(yǎng)液。

1.5 HSV-Ⅱ的接種

轉(zhuǎn)染過的Vero細(xì)胞，每孔接種100個量的TCID50/ 100 μl HSV-Ⅱ，分別于12、24、36、48、60、72 h時觀察細(xì)胞病變［9］。

1.6 MTT比色法測定細(xì)胞活力

按上述24孔板轉(zhuǎn)染的濃度換算，96孔板中每孔加入0.25 μl/孔的Lipofectanmine2000及0.4 μl/孔的siRNA，每組種5個復(fù)孔，同時設(shè)空白組，接種HSV-Ⅱ后每隔12 h用MTT比色法測定各孔細(xì)胞比色值，并繪制細(xì)胞生長曲線圖。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SAS 8.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA的轉(zhuǎn)染率

在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，1 μl/孔Lipofectamine 2000、2 μl/孔siRNA（40 nmol/L）的轉(zhuǎn)染孔中熒光效果最好（圖1、2）。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)染率為76.27％～90.66％（圖3、4）。

圖1 轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下的細(xì)胞（×200）

圖2 同一視野下的細(xì)胞（×200）

圖3 FAM-siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果（轉(zhuǎn)染率為90.66％）

圖4 FAM-siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果（轉(zhuǎn)染率為76.27％）

2.2 病毒感染后細(xì)胞的病變情況

60～72 h時，各轉(zhuǎn)染組所測OD值均較空白組高（P＜0.05）。R2組和R4組在24 h之后（除48 h），所測得OD值明顯高于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而R1組、R3組和陽性對照組在12～48 h所測得OD值與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。陰性對照組在12、60、72 h時所測OD值均高于空白組（P＜0.05），在其他時間所測的OD值均與空白組相當(dāng)（P＞0.05）。MTT比色法測得各時間點各組細(xì)胞活力情況見表1。各組數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機區(qū)組方差分析，結(jié)果見表2。以時間點為橫軸，OD值的平均值為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線圖，見圖5，各組細(xì)胞由于病毒的感染，細(xì)胞均逐漸出現(xiàn)病變，曲線呈現(xiàn)緩慢的下滑趨勢。R2組、R4組和陽性對照組的細(xì)胞生長曲線總體高于空白組，而其他組的生長曲線介于上述各組與空白組之間。

表1 各組在各個時間點的細(xì)胞活力（OD值，x±s）

表2 隨機區(qū)組方差分析表

圖5 MTT法測定下細(xì)胞生長曲線

3 討論

HSV-Ⅱ在與宿主細(xì)胞相互作用的過程中，ICP27通過抑制宿主細(xì)胞原始RNA的剪接和加尾等成熟過程，與UL41基因編碼的病毒宿主關(guān)閉蛋白（virion host shutoff protein，VHS蛋白）共同調(diào)節(jié)宿主mRNA的代謝過程，抑制宿主細(xì)胞蛋白的合成［10-11］。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)具有高度的序列特異性，作用效果類似于基因敲除，是近年來用于研究基因篩選、功能鑒定以及基因治療的先進(jìn)技術(shù)［12-15］。

本研究表明，利用RNAi干擾技術(shù)特異性干擾HSV-Ⅱ病毒α27基因編碼的ICP27合成，可阻斷ICP27干擾的宿主細(xì)胞mRNA代謝，干擾其對宿主蛋白合成的抑制，明顯抑制宿主細(xì)胞的病變，從而起到保護(hù)宿主細(xì)胞的作用。

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)4對針對α27基因的特異性siRNA，雖然按照同樣的設(shè)計原則進(jìn)行設(shè)計，然而作用效果存在明顯差異，R2和R4組干擾效果比其他兩組好，分析其可能的原因有：RNAi的過程可能存在更為復(fù)雜的作用機制；某些靶序列存在蛋白結(jié)合位點，或者某些siRNA序列容易形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，阻止了siRNA與特異性mRNA的結(jié)合；某些特異性序列的siRNA更為不穩(wěn)定，容易被RNA酶降解［16-20］等，這些有待今后進(jìn)一步研究。

總之，本研究構(gòu)建了針對HSV-Ⅱ型病毒α27基因的特異性siRNA，篩選出了有效的、可特異性抑制α27基因表達(dá)的siRNA，證實了α27基因的特異性siRNA可保護(hù)HSV-Ⅱ型感染的宿主細(xì)胞，為臨床篩選抗HSV-Ⅱ藥物新靶點提供了理論基礎(chǔ)。

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Effect of α27-specific siRNA on host cells infecting by herpes simplex virus typeⅡ

YANG Zhao-linCHEN YinWANG LiZHAO Shao-feng▲SHAO Yan-ling
Department of Gynaecology and Obstetrics，Guangfo Hospital Affiliated to the Guangzhou University of Medical Science the Second People's Hospital of Nanhai District in Foshan City，Guangdong Province，F(xiàn)oshan528251，China

Objective To determine the effect of α27-specific siRNA on host cells infecting by herpes simplex virus typeⅡ（HSV-Ⅱ）.Methods Four α27-specific siRNAs（R1，R2，R3，R4 group）and the positive，negative control siRNAs were synthesized in vitro by chemical process.The Vero cells were transfected with siRNAs using Lipofectamine2000 followed by HSV-Ⅱinfecting.The activity of the cells were measured at 12，24，36，48，60，72 h by MTT.Results Groups with α27-specific siRNA had higher OD values by MTT colorimetric assay than blank cells，with better survive situation.R2 and R4 group had better survival than other groups.Conclusion α27-specific siRNA can protect host cells of HSV-Ⅱ.There are obvious differences of inhibition effect of siRNA which are synthesized in accordance with the same priciples.

α27 gene；siRNA；RNAi；HSV-Ⅱ；Vero cell

Q936

A

1674-4721（2015）05（b）-0007-04

2015-01-18本文編輯：衛(wèi)軻）

廣東省科技計劃項目（2010B031600177）

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