正交試驗法優(yōu)化超聲波提取苦楝果實中川楝素*

裴愛田

(淄博職業(yè)學院，山東 淄博255314)

苦楝(Melia azedarach Linn)在中國分布廣泛，其果實的產(chǎn)量非常大，川楝素(Toosendanin)是苦楝果實的主要活性成分之一。川楝素具有驅蟲、殺蟲等功效，同時具有非常好的抗肉瘤效應，能誘導細胞分化、凋亡并抑制人和動物的多種腫瘤細胞繁殖［1］。將川楝素應用于殺蟲、制藥行業(yè)具有非常重要的意義。目前，苦楝果實中川楝素的提取方法主要有浸提法［2］、索氏提取法［3］、超聲提取法［4～5］、微波輔助提取法［6］和超臨界 CO2萃取法［7～8］等。超聲提取法具有設備投資少、操作簡單、省時省力、易于掌握和推廣等優(yōu)點，目前已被廣泛應用于生物活性物質的提?。?］。正交試驗法是一種有效優(yōu)化提取工藝條件的方法，采用極差分析和方差分析研究各因素之間的相互作用，以較少的試驗次數(shù)及較短的時間對選擇的試驗參數(shù)進行優(yōu)化，該方法已廣泛應用于生物、化工及食品加工技術的條件優(yōu)化。裴愛田［10］對苦楝素中川楝素的粗提物穩(wěn)定性進行了研究，而利用正交試驗優(yōu)化超聲波提取苦楝中川楝素未見報道。本研究在單因素試驗的基礎上，采用無重復試驗正交設計和極差分析對超聲法提取苦楝果實中的川楝素的工藝條件進行了優(yōu)化，為進一步開發(fā)利用苦楝資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗材料苦楝果實購自山東淄博醫(yī)藥商城;川楝素對照品來自中國食品藥品檢定研究院。95%乙醇、甲醇、氯仿、乙醚、苯、石油醚、乙酸乙酯均為分析純。試驗儀器KQ-300V超聲波清洗器型(昆山市超聲儀器有限公司);BSA224S-CW電子天平〔賽多利斯科學儀器(北京)有限公司〕;FZ-102中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司);RV06-ML旋轉蒸發(fā)儀(德國 IKA公司);DZF-6050真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑的選擇精密稱取過40目篩的苦楝果實粉末6份，每份5 g，分別加入95%乙醇、甲醇、氯仿、水、石油醚、乙酸乙酯100 mL于500 mL三角燒瓶中，置超聲波清洗器中提取。超聲功率300 W，提取時間10 min，提取液經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀濃縮后定量轉移，并用提取劑定容至一定體積，得樣品制備液。樣品制備液經(jīng)液相色譜儀檢測，計算川楝素的提取率，根據(jù)提取率選擇合適的溶劑。

1.2.2 川楝素的定量

稱取一定量的川楝素對照品，用甲醇配制成濃度為 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL 的標準系列，在液相色譜儀上進行測定。

測定時的色譜條件為，檢測器波長215 nm;C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5μm);柱溫25℃;流動相甲醇水溶液梯度洗脫，甲醇︰水在20 min內由40%～100%;流速1mL/min;進樣量20μL。

1.2.3 正交試驗設計

參照許海燕等［11］的方法為評價指標，以市售苦楝果實為材料，設計4因素4水平的L16(45)正交試驗(表1)，研究甲醇濃度、提取時間、料液比、超聲波功率對川楝素提取的影響。其中甲醇濃度分別為40%、50%、60%和70%;提取時間分別為20 min、30 min、40 min和50 min;料液比分別為1︰5、1︰10、1︰20和1︰30;超聲波功率分別為150 W、200 W、250 W和300 W。

表1 正交試驗因素及水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 方法學試驗

(1)精密度試驗 取川楝素對照品溶液，按照方法1.2.2設定的色譜條件下重復進樣6次，計算川楝素峰面積的相對標準偏差(RSD)。

(2)重復性試驗 取同一苦楝果實6份，按照方法1.2.1設定的條件制備供試液，按照方法

1.2.2設定的色譜條件分別測定，測得川楝素的平均含量，計算川楝素含量的RSD。

(3)穩(wěn)定性試驗 取同一供試液，室溫密閉放置，分別在制備后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h進樣，計算川楝素峰面積的RSD。

(4)加標回收率試驗 準確稱取已知含量的苦楝果實樣品粉末，共9份，分別準確加入一定量的川楝素對照品，按照方法1.2.1設定的條件制備供試液，按照方法1.2.2設定的色譜條件測定，計算平均回收率及回收率的RSD。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇結果

6種提取溶劑對苦楝果實中川楝素提取率見表2。在相同條件下，不同提取劑對苦楝果實中川楝素的提取率有較大的影響，而且提取的成分也不完全相同，用乙醇作提取劑時，有與川楝素在HPLC儀上難以分開的物質被提取出來，甲醇作提取劑時，提取液中的川楝素能在1.2.2選定的色譜條件下與樣品中的其他組分很好地分離。因此，選用甲醇作提取溶劑。

表2 不同提取溶劑對川楝素提取效率的影響Tab.2 Effect of the toosendanin yield of different solvents

表3 L16(45)正交試驗設計結果Tab.3 Results of16(45)orthogonal test

2.2 川楝素最佳提取工藝條件的確定

參照許海燕等［11］的方法，對苦楝果實中川楝素提取工藝條件中甲醇濃度、提取時間、料液比、超聲波功率等4因素4水平正交試驗結果進行統(tǒng)計分析，結果見表3。

由表3中極差R可以看出，對苦楝果實中川楝素提取率的影響因素由大到小依次是，甲醇濃度＞料液比＞提取時間＞超聲波功率。從產(chǎn)率看，甲醇濃度為70%、提取時間20 min、料液比為1 g︰30 mL、超聲波功率為200 W時，川楝素的產(chǎn)率最高，據(jù)此選定該條件組合為超聲波法提取川楝素的最佳工藝條件。正交試驗結果方差分析見表4。

表4 正交試驗結果方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal test

經(jīng)方差分析可知，利用超聲波提取法提取苦楝果實中的川楝素，甲醇濃度對川楝素提取效果有統(tǒng)計學意義。

表5 加標回收率試驗結果Tab.5 Results of the recovery test

2.3 方法學實驗結果

(1)液相色譜法測定川楝素精密度試驗結果

川楝素對照品溶液重復進樣6次的峰面積依次是223.357、224.078、226.585、228.973、221.264、227.456，其RSD為1.58%，表明該液相色譜法測定川楝素的精密度良好。

(2)超聲波法提取川楝素重復性試驗結果同一苦楝果實中川楝素6次測定結果依次是0.32%、0.32%、0.30%、0.31%、0.32%、0.32%，平均含量為0.32%，測定結果的RSD為2.66%，表明超聲波法提取苦楝果實中川楝素的重復性良好。

(3)川楝素穩(wěn)定性試驗 同一供試液放置不同時間后測得的峰面積依次是118.742、116.578、115.433、114.553、110.256，其 RSD為2.72%，表明川楝素供試液在8 h內穩(wěn)定。

(4)加標回收率實驗 苦楝果實中川楝素加標回收率實驗結果見表5。從表5可知，該方法的平均回收率為96.89%，回收率的RSD為0.99%，符合分析要求。

3 結論與討論

川楝素具有驅蛔蟲、蟯蟲和鞭蟲等驅蟲功效，也是一種植物源殺蟲劑，同時還具有誘導腫瘤細胞分化、凋亡，抑制人和動物的多種腫瘤細胞繁殖的作用，能夠阻斷突觸前傳遞，抑制多種鉀通道等。本項目在通過單因素試驗選取了對結果影響較大的4個因素，采用正交設計和極差分析對這4個因素進行了優(yōu)化，為進一步開發(fā)利用苦楝資源提供依據(jù)。

(1)本項試驗先通過單因素試驗探索超甲醇濃度、提取時間、料液比及超聲波功率對苦楝果實中川楝素提取率的最佳參數(shù)，利用L16(45)正交試驗設計得出了提取苦楝果實中川楝素的最佳工藝條件為，甲醇濃度70%，固液比1 g︰30 mL，提取時間20 min，超聲功率200 W。在此條件下，苦楝果實中川楝素的提取率為0.32%。

(2)本項試驗采用正交設計，具有試驗次數(shù)少，能在較短時間內對所選的試驗參數(shù)進行較全面的研究，試驗結果具有一定的參考價值和實用價值。

(3)本項試驗采用了超聲波提取苦楝果實中川楝素，該方法具有效率高、能耗少、無污染、提取成分不被破壞等優(yōu)點，可以應用于苦楝果實中川楝素的提取。

(4)本項試驗采用了液相色譜法測定苦楝果實中的川楝素含量，方法的精密度、穩(wěn)定性、重復性、加標回收率均良好，表明該方法適合用于苦楝果實中川楝素的提取和測定。

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