環(huán)丙沙星和四氰基乙烯的荷移反應及其熒光特性的研究

鞏忠萍，杜夢圓，宋 笛，高蕻冰，杜浩然，于莉莉，吳 江，呂奎霖，葛爭紅，石春卉，李 燁，呂玉光

(1.佳木斯大學 藥學院，黑龍江佳木斯，154007;2.佳木斯大學 國際教育學院，黑龍江佳木斯，154007;3.佳木斯大學口腔醫(yī)學院，黑龍江佳木斯，154002;4.北京化工大學材料科學與工程學院，北京100029;5.北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，北京100101)

環(huán)丙沙星作為第3代喹諾酮類藥物的典型代表之一，具有抗菌譜廣，毒副作用小，血藥濃度高，半衰期長，制劑形式多樣，藥效價格比高等特點［1］，使其廣泛應用于臨床治療中.與此同時發(fā)展出了一系列的檢測環(huán)丙沙星方法，例如有分光光度法［2－3］、高效液相色譜法［4－6］和熒光光度法［7］.在 Mulliken 等［8］首次提出了電荷轉移絡合物理論后，許多人對這一理論進行了深入的研究.電荷轉移絡合物(charge transfer complex，CTC)是由富含電子的分子和缺電子物質之間通過電荷轉移而構成的絡合物［9］.由于許多藥物中含有富電子基團(氨基、吡啶等)，因此能夠與電子受體(四氰基乙烯等)形成穩(wěn)定的荷移絡合物［10］，且基于此理論方法進行的藥物定量分析法具有簡便準確，靈敏度高等特點［11－12］.應用荷移反應對喹諾酮類藥物含量測定的方法研究多限于分光光度法［13］，而采用熒光光譜對喹諾酮類藥物荷移反應的研究還很少被報道.

基于此，選取四氰基乙烯為電子受體試劑來和環(huán)丙沙星構筑荷移絡合物，研究其最佳合成條件.通過體系的熒光增強效應，建立了新型的檢測環(huán)丙沙星藥物的新方法.同時，還對其荷移絡合物的形成機理進行了研究.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

970CRT熒光分光光度計(上海儀器分析制作總廠);UV/Vis－265紫外－可見光分光光度計;環(huán)丙沙星標準溶液:準確稱取10 mg的環(huán)丙沙星標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號:00120000，純度≥99.0%)，加少量甲醇溶解，配置成100 mg/L的標準溶液，使用時逐級稀釋至所需濃度;四氰基乙烯標準液:準確稱取64 mg四氰基乙烯標準品，加少量丙酮溶解，配置成5×10－3mol/L的標準溶液;所用其余試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水.

1.2 實驗方法

在10 mL具塞比色管中用移液管準確吸取適量環(huán)丙沙星甲醇溶液，然后分別加入2.5mL的四氰基乙烯工作液，然后用無水甲醇定容至刻度線，充分搖勻.將其置于40℃的恒溫水浴箱中加熱40 min.冷卻至室溫.將樣品置于熒光比色池中，以331 nm為激發(fā)波長，與437 nm處測量荷移絡合物的熒光強度.以同樣的方法進行空白試驗.

2 結果與討論

2.1 環(huán)丙沙星荷移反應前后的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜和紫外光譜

按實驗方法配制試液，分別對所得荷移反應產(chǎn)物和環(huán)丙沙星和空白試劑進行熒光激發(fā)和發(fā)射掃描(見圖1).由圖1可知，環(huán)丙沙星自身能發(fā)射熒光.當與四氰基乙烯發(fā)生荷移反應后，熒光激發(fā)和發(fā)射峰的位置變化不大，但熒光強度卻顯著增強，這表明環(huán)丙沙星與四氰基乙烯荷移絡合物的生成.

按實驗方法配置溶液后，在UV/Vis－265分光光度計上掃描，繪制吸收光譜如圖2所示，表明絡合物在409 nm處有最大吸收峰，而TCNE和CPFX的最大吸收峰分別位于328 nm和327 nm，說明了荷移絡合物的形成.

2.2 四氰基乙烯用量的影響

分別取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL的四氰基乙烯加入到含有4 mL環(huán)丙沙星的比色管中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，40℃水浴中保溫40 min，冷卻至室溫，測定熒光強度，結果如圖3所示.實驗結果表明:當四氰基乙烯的用量在0.3 mL時熒光增強最大.用量過低則反應不完全;而用量高時導致熒光強度下降.

2.3 環(huán)丙沙星用量的影響

分別取 1，2，3，4，5，6，7，8 mL 的環(huán)丙沙星溶液到含有0.3 mL四氰基乙烯的比色管中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，40℃水浴中保溫40 min，冷卻至室溫，測定熒光強度，結果如圖4所示.實驗結果表明:當環(huán)丙沙星的用量在4 mL時熒光增強最大.

2.4 反應溫度的影響

按實驗方法，在固定其他實驗條件不變的情況下，考察溫度對熒光強度的方法.選取最佳的試劑質量濃度分別加至不同的比色管中，然后置于不同的恒溫水浴鍋中，控制溫度分別為 20、30、40、50、60 ℃加熱40 min.結果如圖5所示，結果表明當溫度處于40℃以下時，體系的熒光強度隨著溫度的增高而依次增強.但在40℃后體系的熒光強度逐漸穩(wěn)定.本實驗選擇40℃為最佳反應溫度.

2.5 反應時間的影響

選取確定的最佳實條件，考察反應時間對荷移絡合物的影響.選取最佳反應質量濃度的試劑置于不同比色管中，控制溫度在40℃，反應時間分別為10、20、30、40、50、60 min，其熒光強度變化如圖 6 所示，環(huán)丙沙星與四氰基乙烯發(fā)生電荷轉移反應最佳反應時間為40 min.

2.6 標準曲線與檢出限

準確配置質量濃度為1.0～100 mg/L的環(huán)丙沙星溶液，按上述建立的實驗方法，對不同質量濃度的荷移絡合物體系進行熒光光譜掃描，選取最佳的實驗條件，結果表明環(huán)丙沙星質量濃度－熒光強度曲線中當環(huán)丙沙星質量濃度為0.2～8.1 mg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關系，線性回歸方程為F=139.2ρ+2.564 1;相關系數(shù)r=0.999 4;檢出限為0.2 mg/L.

2.7 反應機理初探

四氰基乙烯是一個很強的平面型π電子受體，而環(huán)丙沙星分子中的哌嗪基上的氮原子有一對孤對電子，可作為電子供體，與四氰基乙烯形成1∶1的n－π型荷移絡合物，其形成過程可表示如圖7所示.

3 樣品分析

在丙酮－甲醇介質中，環(huán)丙沙星能與四氰基乙烯形成穩(wěn)定的電荷轉移絡合物，最佳的反應溫度為40℃，反應時間為40 min，其熒光強度較環(huán)丙沙星有顯著的提高.因此，該法可作為用于測定藥物中環(huán)丙沙星的含量的新方法，且反應條件溫和，速度快，靈敏度高.

3.1 待測樣品溶液的配置

分別取2個不同廠家生產(chǎn)的鹽酸環(huán)丙沙星片劑10片，經(jīng)過準確稱量記錄后，研成粉末狀.準確稱取其總質量的1/10，用甲醇溶液溶解，精密稱取濾液5 mL，用甲醇定容至100 mL容量瓶中，備用.

3.2 樣品測定及回收率

分別量取適量的鹽酸環(huán)丙沙星樣品溶液，置于10 mL比色管中，按照上述實驗所確定的最佳條件和方法，計算出樣品實際含量.準確量取適量的鹽酸環(huán)丙沙星對照品，通過熒光強度來計算回收率，結果表1所示.

本方法和藥典法無系統(tǒng)誤差，回收檢驗結果令人滿意，其回收率為97.69% ～100.12%;相對標準偏差小于2.5%.

4 結語

在丙酮－甲醇介質中，環(huán)丙沙星能與四氰基乙烯形成穩(wěn)定的電荷轉移絡合物，最佳的反應溫度為40℃，反應時間為40 min，其熒光強度較環(huán)丙沙星有顯著的提高.因此，該法可作為用于測定藥物中環(huán)丙沙星的含量的新方法，且反應條件溫和，速度快，靈敏度高.

表1 鹽酸環(huán)丙沙星片劑分析結果(n=5)

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