恙蟲病東方體三種膜蛋白抗原包被酶聯(lián)免疫吸附試驗的特異性和敏感性分析*

汪鵬程 熊小路 焦 俊 龔文平 楊曉梅 溫博海

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071；2.中國人民解放軍第105醫(yī)院檢驗科， 合肥 230031)

恙蟲病(Tsutsugamushi disease/fever)，又稱叢林斑疹傷寒(scrub typhus)，是由恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi)引起的一種自然疫源人獸共患急性發(fā)熱性疾病。嚙齒動物(鼠類)是該病的主要傳染源，恙螨(特別是纖恙螨屬Leptotrombidium)的幼蟲是其傳播媒介(Traubetal., 1974)。恙蟲病主要在亞洲和的太平洋地區(qū)流行(Wattetal., 2003)，我國從南到北大部分地區(qū)存在恙蟲病，近年在某些地區(qū)出現(xiàn)恙蟲病暴發(fā)流行(Deetal., 2015)。恙蟲病臨床上以突然高熱、淺表淋巴結(jié)腫大、蟲咬處潰瘍焦痂和皮疹為主要特征(Wattetal., 2003)。雖然該病用四環(huán)素、氯霉素等抗生素治療有效，但是很多患者的臨床癥狀不典型，容易造成誤診而延誤治療，甚至引起患者死亡(Deetal., 2015)。因此，迫切需要建立有效、實用的方法對恙蟲病進行臨床實驗室診斷。

目前，恙蟲病臨床實驗室診斷的主要方法是血清學(xué)檢測，采用恙蟲病東方體制備抗原片做間接免疫熒光分析(IFA)，檢測患者血清中恙蟲病東方體特異性抗體。恙蟲病東方體是專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，不能在人工培養(yǎng)基上生長，需要靠接種雞胚或細(xì)胞才能繁殖恙蟲病東方體制備IFA抗原片。由于抗原片制備復(fù)雜，難以標(biāo)準(zhǔn)化等限制了IFA恙蟲病抗體檢測在臨床實驗室中的應(yīng)用。采用恙蟲病東方體抗原做酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，檢測恙蟲病特異性抗體是目前國外實驗室用于代替IFA的新型恙蟲病實驗室診斷方法(Chenetal., 2011)。采用恙蟲病東方體全細(xì)胞抗原裂解物與恙蟲病患者血清做免疫印跡，發(fā)現(xiàn)與患者血清反應(yīng)的主要抗原成分有110、58、56、47和22 kDa抗原(Hanson, 1985;Oaksetal., 1989)。56和47 kDa蛋白和是恙蟲病東方體的最主要表面蛋白抗原(Oaksetal., 1989)，而58 kDa蛋白是一熱休克蛋白(Hsp60)(Stoveretal., 1990)。免疫印跡分析顯示幾乎所有恙蟲病患者血清均能與這3個蛋白反應(yīng)(Hanson,1985)。本實驗室已經(jīng)將恙蟲病東方體的這3個主要蛋白抗原的基因克隆表達，制備r58、r56和r47 kDa重組蛋白。本研究用這3個重組蛋白做抗原建立ELISA方法，分別用這3種抗原包被ELISA檢測恙蟲病東方體實驗感染小鼠血清以及恙蟲病患者血清，并同時檢測其他立克次體感染小鼠血清和患者血清，以便對這3種抗原ELISA的特異性和敏感性進行分析，為其進一步的實際應(yīng)用提供必要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

Ni-NTA純化試劑盒為德國QIAGEN產(chǎn)品；低分子量蛋白Marker等為中科瑞泰(北京)生物科技有限公司產(chǎn)品；FITC、HRP標(biāo)記羊抗小鼠/人IgG購自北京博奧森公司；96孔ELISA板購自美國康寧公司；ELISA包被液、封閉液、TMB反應(yīng)底物、終止液均購自eBioscience公司。

多種立克次體抗原片，包括恙蟲病東方體Origentiatsutsugamushi、貝氏柯克斯體Coxiellaburnetii、黑龍江立克次體Rickettsiaheilongjiangensis、莫氏立克次體Rickettsiamooseri為本實驗室制備。

無特殊病原BALB/c小鼠(6周齡，雄性)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。

1.2 立克次體菌株與實驗感染小鼠血清

恙蟲病東方體(Karp株)、貝氏柯克斯體(新橋株)、莫氏立克次體(Wilmington株)、黑龍江立克次體(054株)為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所立克次體學(xué)實驗室保存。用以上立克次體分別腹腔接種BALB/c小鼠，感染4周后活殺小鼠取血，分離血清，血清置-20℃凍存?zhèn)溆?。血清用相?yīng)的立克次體抗原片按常規(guī)方法做間接免疫熒光，其IgG抗體效價≥1∶200。

1.3 立克次體患者血清

恙蟲病、Q熱、斑點熱、斑疹傷寒患者血清由安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院柳燕教授、廣州第八人民醫(yī)院、江蘇省疾病預(yù)防控制中心分別惠贈。以上患者血清用相應(yīng)的立克次體抗原片按常規(guī)方法做間接免疫熒光，其特異性IgG抗體效價≥1∶100。

1.4 恙蟲病東方體重組蛋白制備

將本室制備的恙蟲病東方體Karp株47、56、58 kDa蛋白基因重組大腸埃希氏菌(Yuetal., 2005)接種含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基。按常規(guī)方法用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化菌表達重組蛋白，對復(fù)蘇的重組菌做聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，鑒定重組菌表達的目的蛋白。對表達目的蛋白重組菌接種含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達。用Qiagen公司的Ni-NTA試劑盒從裂解的重組菌中分離純化目的重組蛋白。

1.5 ELISA檢測立克次體感染小鼠/患者血清

將純化的重組蛋白用ELISA包被液稀釋至3 μg/mL，再分別加至ELISA板各孔中(每孔100 μL)4℃包被過夜。包被結(jié)束后棄上清，加入PBST進行洗滌(每孔加入200 μL，搖振5 min)，拍干后每孔加入200 μL封閉液4℃過夜，PBST洗滌3次后待用。將每份大腸埃希氏菌(5 mg/mL)中和后血清用封閉液作1∶200倍稀釋。將每份稀釋血清加入到相應(yīng)孔中，37℃孵育1 h。PBST洗滌3次后拍干，加入1∶4000稀釋的辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠或人IgG抗體，37℃孵育1 h。PBST洗滌3次后拍干。每孔加入100 μL TMB底物，10 min后加入100 μL終止液，立即于酶標(biāo)儀上測定OD450值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

每組血清與單個重組蛋白反應(yīng)OD450值差異采用單因素K水平方差分析及Student-Newman-Keuls分析。以上統(tǒng)計學(xué)分析均使用SAS 9.1軟件完成。統(tǒng)計正常血清與每個蛋白反應(yīng)OD450值，以正常小鼠血清或正常人血清與單個蛋白反應(yīng)OD450平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差為Cut-off值，判斷感染血清與該蛋白反應(yīng)陽性及陰性結(jié)果。分析每個主要血清反應(yīng)蛋白與其他立克次體感染血清反應(yīng)的OD450值來分析恙蟲病東方體重組蛋白抗原的特異性。

2 結(jié)果

2.1 恙蟲病東方體重組蛋白的制備

將恙蟲病東方體47、56、58 kDa蛋白基因重組菌接種含有氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基。在IPTG誘導(dǎo)下，這3個重組菌均表達目的蛋白。采用Ni-NTA對表達的重組蛋白進行分離純化，SDS-PAGE分析確認(rèn)獲得分子量與設(shè)計大小一致的3個重組蛋白(r47、r56、r58 kDa蛋白)(圖1)。

圖1 SDS-PAGE分析恙蟲病東方體重組蛋白在大腸埃希氏菌中表達Fig.1 SDS-PAGE analysis for the expression of recombinant proteins of Orientia tsutsugamushi in E.coli cells

2.2 ELISA分析恙蟲病重組蛋白與小鼠血清反應(yīng)敏感性及特異性

將恙蟲病東方體、貝氏柯克斯體、黑龍江立克次體、莫氏立克次體感染小鼠血清以及正常小鼠血清各8份分別與恙蟲病東方體r47、r56、r58 kDa蛋白進行ELISA反應(yīng)，結(jié)果顯示每種重組蛋白至少與7份恙蟲病東方體感染血清陽性反應(yīng)，每個重組蛋白與恙蟲病東方體感染血清的平均反應(yīng)OD值均顯著高于與其他立克次體感染小鼠血清的平均OD值(表1，圖2)。而其他立克次體感染小鼠血清與這3種重組蛋白的反應(yīng)均為陰性。

2.3 ELISA分析恙蟲病重組蛋白與患者血清反應(yīng)敏感性及特異性

將12份恙蟲病、11份Q熱病人、13份斑點熱、11份斑疹傷寒患者血清、17份正常人血清與恙蟲病東方體47、56、58 kDa蛋白行ELISA反應(yīng)，結(jié)果顯示12份恙蟲病患者血清中有11份與這3種重組蛋白的反應(yīng)為陽性，恙蟲病患者血清與每一種蛋白反應(yīng)的平均OD值均顯著高于與其他立克次體感染患者血清反應(yīng)的OD值(表2)。而其它立克次體感染患者血清與這3個恙蟲病東方體重組白的反應(yīng)陽性數(shù)為0或1～3份。

表1 立克次體感染小鼠血清與恙蟲病東方體r47、r56、r58 kDa蛋白的ELISA反應(yīng)強度及陽性數(shù)Tab.1 The reaction intensities and positive rates of sera from mice infected with different rickettsiae in ELISA with 47-, 56-, or 58-kDa recombinant protein of Orientia tsutsugamushi

表2 立克次體感染患者血清與恙蟲病東方體r47kD、r56kD、r58kD蛋白的ELISA反應(yīng)強度及陽性率Tab.2 The reaction intensities and positive rates of sera from patients suffered from different rickettsial diseases in ELISA with 47-, 56-, or 58-kDa recombinant protein of Orientia tsutsugamushi

圖2 立克次體感染小鼠血清與恙蟲病東方體r47、r56、r58 kDa蛋白的ELISA反應(yīng)強度散點圖Fig.2 The reaction intensities of sera from mice infected with different rickettsiae in ELISA with 47-, 56-, or 58-kDa recombinant protein of Orientia tsutsugamushi

圖3 立克次體感染患者血清與恙蟲病東方體r47、r56、r58 kDa蛋白的ELISA反應(yīng)強度散點圖Fig.3 The reaction intensities of sera from patients suffered from different rickettsial diseases in ELISA with 47-, 56-, or 58-kDa recombinant protein of Orientia tsutsugamushi

3 討論

恙蟲病東方體的47、56、58 kDa表面蛋白為其主要抗原。58 kDa蛋白為Hsp60家族成員，雖然細(xì)菌熱休克蛋白為高保守蛋白，但是基因序列分析證明恙蟲病東方體58 kDa蛋白基因與最近緣的斑疹傷寒立克次體的Hsp60也有較大的差異；免疫印跡分析顯示58 kDa蛋白與其他立克次體Hsp60蛋白免疫血清僅有微弱的交叉反應(yīng)；58 kDa蛋白在恙蟲病東方體菌株之間則為高度保守，提示58 kDa蛋白適用于做恙蟲病血清學(xué)診斷抗原(Stoveetal., 1990)。56 kDa蛋白為恙蟲病東方體特有的外膜蛋白，用重組56 kDa蛋白做包被抗原對澎湖列島恙蟲病患者血清做ELISA分析，發(fā)現(xiàn)98%的患者血清有特異性IgM抗體升高，100%的患者血清有特異性IgG抗體升高,證明56 kDa蛋白具有很好的恙蟲病血清學(xué)特異性和敏感性(Chenetal., 2011)。47 kDa蛋白為細(xì)菌HtrA(High-temperature requirement A)家族蛋白，該蛋白位于革蘭陰性菌的外膜和周漿。47 kDa蛋白也是恙蟲病東方體的保守蛋白，免疫印跡分析證明其能與大多數(shù)恙蟲病患者血清反應(yīng)(Chenetal., 2009)；用47 kDa蛋白做包被抗原對澎湖列島恙蟲病患者血清做ELISA分析，結(jié)果顯示76% 和 93% 的恙蟲病患者血清分別有升高的特異性IgM和IgG抗體，證明其也具有很好的恙蟲病血清學(xué)特異性，但敏感性比56 kDa蛋白稍差(Chenetal., 2011)。

采用Ni-NTA對表達的重組蛋白進行分離純化，SDS-PAGE分析中47和58 kDa蛋白分別有兩條帶，可能與蛋白降解有關(guān)。本研究用恙蟲病東方體r47、r56、r58 kDa蛋白分別做包被抗原對恙蟲病東方體感染小鼠血清做ELISA分析。結(jié)果顯示8份恙蟲病感染小鼠血清中除1份血清與r58 kDa蛋白的IgG特異抗體反應(yīng)為陰性外其它均為陽性；而這3個重組蛋白與貝氏柯克斯體(Q熱病原體)、莫氏立克次體(地方性斑疹傷寒病原體)、黑龍江立克次體(遠東斑點熱病原體)感染小鼠血清的IgG特異抗體反應(yīng)均為陰性，證明這3個重組蛋白抗原均具有識別恙蟲病東方體感染血清的高度特異性和敏感性，可用作恙蟲病的血清學(xué)診斷抗原。

為了進一步證明它們做恙蟲病血清學(xué)診斷抗原的可行性，將r47、r56、r58 kDa分別做包被抗原對恙蟲病患者血清做ELISA。結(jié)果顯示12份恙蟲病患者血清對這3個蛋白抗原的IgG特異抗體反應(yīng)僅1份為陰性，陽性率均為91%。同時，r47 kDa抗原對11份Q熱患者血清、11份斑疹傷寒患者血清、13份斑點熱患者血清的IgG特異抗體反應(yīng)陽性率分別有27%、18%、23%(平均23%)，r56 kDa抗原對這3種患者血清分別為27%、0%、8%(平均11%)，r58 kDa抗原則分別為18%、18%、23%(平均20%)。這些結(jié)果顯示這3個恙蟲病東方體重組蛋白抗原均有識別恙蟲病患者血清的良好特異性和敏感性，特別是r56 kDa抗原對斑疹傷寒和斑點熱患者血清的交叉反應(yīng)水平很低。由于本研究所收集的患者血清絕大多數(shù)來自農(nóng)村地區(qū)，這些恙蟲病東方體IgG抗體陽性的Q熱、斑疹傷寒、斑點熱患者可能曾經(jīng)得過恙蟲病。因此，如果用這3種恙蟲病東方體抗原做ELISA，檢查患者血清中的特異性IgM抗體可以排除交叉反應(yīng)，提高該ELISA血清學(xué)診斷的特異性。

本研究首次將恙蟲病東方體r58、r56、r47 kDa重組蛋白同時做ELISA檢測恙蟲病東方體、貝氏柯克斯體、莫氏立克次體、黑龍江立克次體實驗感染小鼠血清和臨床患者血清，證明它們均有識別恙蟲病東方體感染的良好特異性和敏感性。這4種立克次體感染為我國農(nóng)村地區(qū)常見傳染病，用這3種重組蛋白抗原建立的ELISA將為我國恙蟲病血清學(xué)診斷提供新的有效方法。