甲狀腺乳頭狀癌中PTEN 蛋白和腫瘤壞死因子的表達及意義

宋潤波 馬建亭 孟增智 賈慶雨 董耀 劉偉

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤，也是頭頸部常見的惡性腫瘤之一。研究資料表明，甲狀腺癌占頭頸部惡性腫瘤的5.11%，占全身惡性腫瘤的0.22%～1.0%［1］。甲狀腺癌也是近年來發(fā)病率增長較快的惡性腫瘤。據來自國際癌癥學會資料的統(tǒng)計顯示:甲狀腺癌在世界各國的發(fā)病率逐年上升。在我國，通過流行病學的調查，甲狀腺癌的發(fā)病率也逐年上升。不同于一般癌腫多發(fā)生于老年人，甲狀腺癌較多發(fā)生于年輕女性，年齡35 ～50 歲，男女比為1∶2.6。甲狀腺癌中最常見的是分化型甲狀腺癌(differentiated thyroidcarcinoma，DTC)，占所有甲狀腺癌的95%。分化型甲狀腺癌又分為乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)占DTC 的85%和濾泡狀甲狀腺癌(follictalar thyroid carcinoma，F(xiàn)TC)，占DTC 的15%［1］。當前，甲狀腺癌的發(fā)病機制不甚明了。PTEN 蛋白是1997 年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，研究顯示PTEN 蛋白與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移、浸潤密切相關。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是單核巨噬細胞產生的細胞因子，對腫瘤具有調控作用［2］。本實驗應用免疫組化的方法檢測PTEN 蛋白和TNF-α 在甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺腺瘤中的表達，檢測PTEN 蛋白和TNF-α 與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素的關系。探索PTEN 蛋白和TNF-α在甲狀腺癌的病因、檢查、治療、預后等方面的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取石家莊市第三醫(yī)院2009 至2014 年甲狀腺乳頭狀癌切除標本共60 例，患者進行手術前沒有應用放療和化療，所切取標本均有病理診斷。其中男24 例，女36 例;年齡25 ～76 歲，平均年齡(40.5±8.4)歲。甲狀腺腺瘤切除標本60 例，男28 例，女32 例;年齡22 ～78 歲，平均年齡(46.7±5.6)歲。2 組所切取標本患者的年齡、性別比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

1.2 試劑及方法免疫組化染色所用試劑為鼠抗人PTEN 蛋白免疫組化單克隆抗體(即用型)、鼠抗人TNF-α 免疫組化單克隆抗體(即用型)及SP 法試劑盒，購于上海華東生物工程有限公司。DAB 顯色劑(氨基聯(lián)苯胺試劑盒)、PBS(磷酸鹽緩沖液)、檸檬酸緩沖液及其他免疫組化試劑均由石家莊市第三醫(yī)院病理科提供。操作原理為抗原結合抗體，通過已知抗體檢測抗原。按照SP 試劑盒說明書嚴格進行操作。陰性對照用PBS 代替一抗，陽性對照為試劑盒中陽性片。所有切片來自石家莊市第三醫(yī)院病理科，使用同一批號試劑來完成免疫組化染色。

1.3 結果判定PTEN 蛋白和TNF-α 的免疫組化結果通過DAB 顯色系統(tǒng)顯色，陽性表現(xiàn)為深淺不一的黃色顆粒位于細胞質內。依照參考文獻［3］免疫組化的結果通過半定量積分的方式進行判斷，隨機確定染色較為清楚的高倍視野6 ～7 個，每個視野計數(shù)200 個細胞，陽性細胞占同類計數(shù)細胞比例＜5%記為0 分，6%～25%記為1 分，26%～50%記為2 分，51%～75%記為3 分，＞75%記為4 分。染色強度以陽性細胞顏色為衡量標準:不染色=0 分，淡黃色=1 分，黃色=2 分，棕黃色=3 分。陽性細胞所占比例與染色強度的乘積作為細胞的表達水平:0 分=陰性(－)，1 ～4分=弱陽性(+)，5 ～8 分=中度陽性(++)，9 ～12分=強陽性(+++)。(－)～(+)視為陰性表達，(++)～(+++)視為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學分析應用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，各組間比較應用pearson χ2檢驗和Fisher 確切概率檢驗。PTEN 蛋白和TNF-α 的實驗數(shù)據的關系采用Spearson 秩相關分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺腺瘤中PTEN 蛋白和TNF-α 的表達甲狀腺乳頭狀癌組織中PTEN 蛋白陽性表達率顯著低于在甲狀腺腺瘤中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。甲狀腺乳頭狀癌組織中TNFα 陽性表達率顯著高于甲狀腺腺瘤中的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表1。

表1 甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺腺瘤中PTEN 蛋白和TNF-α 的表達n=60

2.2 PTEN 蛋白和TNF-α 的表達與甲狀腺癌臨床病理因素的關系不同性別、年齡、腫瘤大小的患者，癌組織中二者的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。而有無淋巴結轉移、有無漿膜浸潤、不同TNM臨床分期的患者，癌組織中PTEN 蛋白和TNF-α 的陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 PTEN 蛋白和TNF-α 的表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素的關系 例

2.3 相關性檢驗60 例甲狀腺乳頭狀癌中PTEN 蛋白和TNF-α 同時表達陽性的例數(shù)為6 例，同時表達陰性的例數(shù)18 例，PTEN 蛋白表達陽性而TNF-α 表達陰性者10 例，PTEN 蛋白表達陰性而TNF-α 表達陽性者15 例。通過Spearson 秩相關分析顯示:兩者在甲狀腺乳頭狀癌中的表達呈負相關(r = －0.338，P ＜0.05)。

3 討論

PTEN 蛋白定位于人染色體10q23.3 位點，全長約200 kb［4］，是由Li 等［4］3 個研究小組在1997 年發(fā)現(xiàn)并克隆到的一種抑癌基因，具有較高的突變率和缺失率。通過對PTEN 蛋白開放讀碼框架序列分析表明:細胞骨架蛋白張力蛋白(tensin)與PTEN 蛋白有176 個氨基酸序列與同源，所以被命名PTEN 蛋白。PTEN 蛋白中由403 個氨基酸組成的一條多肽鏈構成氨基端的磷酸酶結構域，其末端區(qū)域具有雙特異性磷酸酶功能，是到目前為止發(fā)現(xiàn)并確定的唯一具有蛋白酪氨酸磷酸酶和脂質磷酸酶活性的雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因。它不但具有抑癌基因的特性，還具有磷酸酶活性。而PTEN 蛋白的氨基端的磷酸酶結構域易發(fā)生突變而失活?，F(xiàn)已證實:正是該結構域的突變、失活與多種腫瘤如頭頸部腫瘤、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、膠質細胞瘤及前列腺癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

PTEN 蛋白的生物學功能如下:(1)通過PTEN/PI3K/AKT 信號通路來實現(xiàn)。PI3K 受到特定細胞因子(如IGF，TNF)的刺激，在細胞膜上生成磷脂酰肌醇-3，4，5-磷酸［phosph atidylinositol(3，4，5)-trisphosphate，PIP3］，作為細胞第二信使，PIP3 與絲、蘇氨酸激酶(AKT)或蛋白激酶B(PKB)結合，使其被磷酸化而活化。活化的AKT 再進一步活化其下游因子，調節(jié)細胞分化、凋亡。在該信號通路中，PTEN 蛋白對PI3K/AKT 通路起著拮抗作用。PTEN 蛋白使PIP3 去磷酸化為PIP2，從而抑制PI3K 的磷酸化作用，使PI3K/AKT 通路活化受到抑制，阻斷PKA 及其下游激酶的活性，使細胞周期阻滯在G1 期，干擾細胞生長，促進細胞凋亡。(2)PTEN/ERK/MARK 途徑，PTEN 通過抑制ERK 的激活，阻斷MARK 途徑的磷酸化，抑制細胞的生長和分化［5，6］。(3)PTEN 下調血管內皮生長因子(VEGF-C)的表達并影響其分泌，從而抑制血管生長，進而抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲［7］。(4)PTEN 蛋白可抑制一些肌動蛋白張力纖維的形成，從而抑制細胞生長、遷移及浸潤。對腫瘤細胞的轉移、浸潤起到抑制作用。

本實驗中，PTEN 蛋白在甲狀腺瘤組織中陽性表達率與在甲狀腺乳頭狀癌組織中陽性表達率比較有顯著差異，提示甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生可能與PTEN 的表達下調緊密相關。提示PTEN 蛋白表達下調和缺失可能在甲狀腺腫瘤發(fā)生過程中起到重要作用。

我們分析甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素與PTEN蛋白的關系發(fā)現(xiàn)，PTEN 蛋白的陽性表達與甲狀腺乳頭狀癌的淋巴結轉移、漿膜浸潤、TNM 分期相關。有淋巴結轉移者的PTEN 蛋白表達的陽性率(10.1%)顯著低于無淋巴結轉移的PTEN 蛋白表達的陽性率(31.2%)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。伴漿膜浸潤的PTEN 蛋白表達的陽性率(10.8%)顯著低于不伴漿膜浸潤的PTEN 蛋白表達的陽性率(39.1%)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。Ⅲ、Ⅳ期甲狀腺乳頭狀癌組織PTEN 蛋白表達陽性率(8.6%)顯著低于Ⅰ、Ⅱ期甲狀腺乳頭狀癌組織 PTEN 蛋白表達陽性率(32.4%)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。提示PTEN 蛋白的表達下調及缺失可能與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲、轉移緊密相關。由此推斷PTEN 蛋白表達的下調及缺失可能既是甲狀腺惡性腫瘤發(fā)生的原因之一，而且也與甲狀腺乳頭狀癌的轉移、浸潤和預后緊密相關。

TNF-α 是單核巨噬細胞系統(tǒng)細胞產生的一種蛋白質，它既具有抗腫瘤作用，可導致炎癥、細胞壞死，并能夠抑制腫瘤新生血管的形成，影響腫瘤細胞膜的滲透性，從而引起細胞凋亡。TNF-α 也可與白介素、干擾素等一起對腫瘤細胞起到殺傷作用，使腫瘤生長受到抑制，使機體抗腫瘤能力得到提升［8］。適量存在的TNFα 對機體有保護作用。而過量分泌的TNF-α 則會對機體產生副作用。TNF-α 可刺激單核巨噬細胞分泌白介素、前列腺素等大量血管活性介質，這些血管活性介質既可以促進腫瘤細胞增殖，同時也明顯降低機體的免疫功能。同時，TNF-α 誘導VEGFmRNA 的表達增加，促進VEGF 合成增加，VEGF 可促進腫瘤細胞的增殖并改變淋巴管的生理特性，為腫瘤經淋巴管轉移創(chuàng)造條件。

本實驗結果顯示，甲狀腺乳頭狀癌患者較甲狀腺瘤患者具有較高水平TNF-α 表達，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素與TNFα 的關系顯示:有淋巴結轉移者的TNF-α 表達的陽性率(92.8%)顯著高于無淋巴結轉移的TNF-α 表達的陽性率(53.2%)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。伴漿膜浸潤的TNF-α 表達的陽性率(81.1%)顯著高于不伴漿膜浸潤的TNF-α 表達的陽性率(56.5%)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。Ⅲ、Ⅳ期甲狀腺乳頭狀癌組織TNF-α 表達陽性率(86.9%)顯著高于Ⅰ、Ⅱ期甲狀腺乳頭狀癌組織TNF-α 表達陽性率(62.2%)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。結果表明:甲狀腺腫瘤的發(fā)生，可激活體內單核巨噬細胞過分釋放TNF-α，另一方面腫瘤細胞也可通過自分泌方式分泌TNF-α，并且TNF-α 隨著腫瘤的負荷的不斷增加，腫瘤的分期惡化而進一步升高，過度升高的TNF-α 不但促進腫瘤細胞的增殖、轉移，同時也使機體的免疫功能受到損害［9］，促進甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺乳頭狀癌組織中PTEN 蛋白與TNF-α 的表達呈負相關。分析甲狀腺乳頭狀癌中，TNF-α 可能抑制PTEN 蛋白的活性。促進腫瘤的發(fā)生［10］。而腫瘤的發(fā)生，反過來又使TNF-α 生成增多。由此推測PTEN 和TNF-α 可能協(xié)同參與并促進甲狀腺癌的發(fā)展。

綜上所述，PTEN 蛋白和TNF-α 在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展及轉移的過程中具有重要意義，二者之間的相關性還有待后續(xù)實驗進一步研究。就目前而言，應用二者的聯(lián)合檢測，有利于甲狀腺乳頭狀癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷及預后判斷。

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