電針對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎抗炎機(jī)制研究*

李躍兵 張 泓 李鐵浪 曾序求

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙410208）

電針對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎抗炎機(jī)制研究*

李躍兵 張 泓 李鐵浪 曾序求

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙410208）

目的 研究電針治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法 SD大鼠40只，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、電針組、雙氯芬酸鈉組，每組10只，空白對照組常規(guī)喂養(yǎng)，其余各組采用尿酸鈉溶液注射法建立痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。造模前2 d，空白對照組與模型組予以生理鹽水灌胃，雙氯芬酸鈉組予以雙氯芬酸鈉溶液灌胃，電針穴位組施以電針，各組均實驗前后測量大鼠踝關(guān)節(jié)周徑；蛋白印跡法、熒光定量PCR法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）的蛋白和基因表達(dá)。結(jié)果 與空白對照組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯增加，滑膜組織中TNF-α、IL-8蛋白和基因表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組和雙氯芬酸鈉組可明顯減輕模型大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，抑制TNF-α、IL-8的蛋白和基因表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01）；與電針組比較，雙氯酚酸組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 電針具有良好的抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用，能夠抑制TNF-α、IL-8基因和蛋白表達(dá)，以減輕組織的炎性損傷。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎 電針 TNF-α IL-8

痛風(fēng)是由長期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高引起的一種代謝性風(fēng)濕病。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎為痛風(fēng)的典型表現(xiàn)形式［1］，是由于尿酸鹽沉積在關(guān)節(jié)囊、滑囊、軟骨、骨質(zhì)和其他組織中引起關(guān)節(jié)劇烈的紅、腫、熱、痛和功能障礙等癥狀的疾病。隨著人民生活水平的提高，此病發(fā)生率有逐年上升的趨勢。以往治療此病常用非甾類抗炎藥，但由于副作用大，不良反應(yīng)多，臨床使用常受限制。電針治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效可靠［2］，可明顯減輕大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹，減輕異物肉芽腫及局部軟骨組織的破壞，改善關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織的結(jié)構(gòu)，抑制骨膠原纖維大量增生［3］，但其治病機(jī)理不明。本研究基于電針對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）的蛋白和基因表達(dá)的影響，探討電針治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供（清潔級），40只，雄性，體質(zhì)量180～200 g。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心實驗室，飼養(yǎng)溫度24～26℃，濕度50%～70%。

1.2 藥物與試劑 雙氯芬酸鈉（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字J20140017），尿酸鈉晶體（美國Sigma公司，CASNumber：1198-77-2），戊巴比妥鈉 （江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號：WS20130112），核蛋白提取試劑盒（thermo公司，批號：M10058），S-PRabbitHRPKit（DAB）兔Streptavidin-HRP試劑盒 （武漢博士德生物科技有限公司），TNF-α、IL-8mRNA引物 （上海捷瑞生物工程有限公司），TNF-α、IL-8抗體（Ancam公司）。

1.3 儀器 旋渦振蕩器（XW-80A），上海青浦瀘西儀器廠；手握式電動勻漿機(jī)（F6-10），德國FLUKO；低溫冷凍離心機(jī)（3K15），美國Sigma公司；移液器（Pipetman），吉爾森P型移液器；Real-time檢測儀 （ABI-7500），ABI；電泳儀 （miniprotean 3cell），BIORAD公司；電轉(zhuǎn)儀（PS-9），大連競邁科技有限公司；酶標(biāo)儀（MK3），芬蘭雷勃酶標(biāo)儀；水浴鍋（HI1210），Leic公司；暗匣（AX-Ⅱ型），粵華醫(yī)療器械，HM-6805-Ⅰ型經(jīng)穴治療儀（恒明牌）；0.35mm×13mm毫針（華佗牌）等。

1.4 模型制備 疾病動物模型為病理性動物模型［4］，選用1%戊巴比妥鈉（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：WS20140112）腹腔注射麻醉，由大鼠右踝關(guān)節(jié)后側(cè)，6號注射針針口斜面與脛骨成45°夾角插入跟腱內(nèi)側(cè)直至踝關(guān)節(jié)腔，將配制好的質(zhì)量濃度為2.5 g/100mL尿酸鈉溶液100μL注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，空白對照組用生理鹽水同法注射，以關(guān)節(jié)囊對側(cè)鼓脹為注入標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 分組與干預(yù) 40只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。空白對照組按20mL/kg予以生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)2周；模型組，造模前2 d開始，按20mL/kg予以生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)2周；電針組，造模前2 d開始，參照《實驗針灸學(xué)》［5］取右側(cè)足三里、三陰交，毫針直刺，平補(bǔ)平瀉，進(jìn)針后接經(jīng)穴治療儀，電壓9V，電流強(qiáng)度1～3mA，頻率1.5～2Hz，疏密波，強(qiáng)度以大鼠局部皮膚肌肉微顫為度，留針20min，每日1次，連續(xù)2周；雙氯芬酸鈉組予雙氯芬酸鈉（生理鹽水溶解、稀釋）灌胃（1mg/kg），每日1次，連續(xù)2周。

1.6 標(biāo)本采集及檢測 1）大鼠踝關(guān)節(jié)周徑測量。采用繞線法測量以標(biāo)記筆標(biāo)記大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)，測量時，以自制絲線與右后肢紅圈重疊，然后在同一測量尺（最小刻度0.1 cm）上測量其長度，重復(fù)3次，取均值即為關(guān)節(jié)周徑。2）滑膜組織TNF-α、IL-8mRNA表達(dá)測定。提取滑膜組織mRNA，紫外分光光度計鑒定后逆轉(zhuǎn)錄［6］。TNF-α/IL-8反應(yīng)體系：cDNA分別為2μL，20× SYBRGreen PCRMasterMix為32.5μL；去離子水分別為14.5μL；總體積50μL；95℃預(yù)變性10min；95℃變性15 s；退火延伸45 s，共40個循環(huán)。3）滑膜組織TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)測定。采用蛋白印跡法［7］（Western blot）提取滑膜組織的總蛋白，取含30μg總蛋白進(jìn)行變性凝膠電泳。電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉封閉，分別與特異性抗大鼠抗體孵育（TNF-α1∶500；IL-8 1∶10），充分洗滌孵育，以HRP偶聯(lián)抗大鼠抗體，用ECL化學(xué)發(fā)光，X光片曝光顯影：以計算機(jī)掃描圖像進(jìn)行分析，測定灰度值，即為蛋白的表達(dá)量，每個實驗重復(fù)3批不同的樣本。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD-T檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度比較見表1。與空白對照組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，電針組及雙氯芬酸鈉組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯減輕（P＜0.05）；電針組和雙氯芬酸鈉組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。

表1 各組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度比較（cm，±s）

表1 各組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度比較（cm，±s）

與空白對照組同時期比較，*P＜0.01；與模型組同時期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別 n 造模前 造模后空白對照組 10 2.82±0.15 3.13±0.13模型組 10 2.90±0.15 3.18±0.12*電針組 10 2.91±0.15 3.19±0.13△雙氯芬酸鈉組 10 2.75±0.11 3.09±0.19△

2.2 對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α mRNA、IL-8mRNA表達(dá)的影響 見表2。與空白對照組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-αmRNA、IL-8mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，電針組及雙氯芬酸鈉組TNF-αmRNA、IL-8mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；電針組和雙氯芬酸鈉組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）

表2 各組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-mRNA、IL-8mRNA及TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-mRNA、IL-8mRNA及TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)水平比較（±s）

與電針組比較，▲P＜0.01。

組 別 n TNF-αmRNA（μL） IL-8mRNA（μL） TNF-α蛋白（μg）IL-8蛋白（μg）空白對照組 32.45±1.48 4.53±2.48 0.53±0.03 0.21±0.01模型組 37.97±3.54* 10.50±2.81* 1.08±0.04* 0.40±0.07*電針組 34.65±1.58△△ 5.19±4.20△△ 0.80±0.04△△ 0.33±0.03△△雙氯芬酸鈉組 33.97±0.78△△ 6.00±2.53△△ 0.32±0.02△△▲ 0.32±0.03△△

2.3 對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)的影響 見表2?？瞻讓φ战M大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織有少量TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)，與空白對照組比較，模型組大鼠滑膜組織TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，電針組和雙氯芬酸鈉組TNF-α、IL-8蛋白表達(dá)明顯減少 （P＜0.01），電針組和雙氯芬酸鈉組之間比較，TNF-α蛋白表達(dá)雙氯芬酸鈉組低于電針組（P＜0.01），IL-8蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“濕熱痹”范疇，常因飲食不節(jié)傷及脾胃，脾失健運而濕濁內(nèi)生，或平素體虛感受濕熱之邪，邪氣壅于經(jīng)絡(luò)，痹阻氣血經(jīng)脈，并滯留于關(guān)節(jié)筋骨，從而出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、腫大、活動不利等癥狀。本病屬正虛邪實之候，治療應(yīng)從脾腎入手，采用補(bǔ)虛瀉實法。《針灸甲乙經(jīng)》云“足下熱痛不能久坐，濕痹不能行，三陰交主之”。三陰交位于脾經(jīng)，又為足三陰經(jīng)交會穴，有清熱健脾利濕；而足三里為胃經(jīng)的要穴，有補(bǔ)益肝腎之功效。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是原發(fā)性痛風(fēng)最常見的首發(fā)癥狀，好發(fā)于下肢關(guān)節(jié)。目前研究認(rèn)為，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎為尿酸鈉結(jié)晶體在關(guān)節(jié)及周圍組織沉積所引起的急性炎癥反應(yīng)［8-10］。尿酸鈉沉積于滑膜細(xì)胞，與滑膜液中的IgG結(jié)合，被白細(xì)胞及滑膜細(xì)胞吞噬，促使這些細(xì)胞釋放組胺，凝血因子，補(bǔ)體及花生四烯酸等物質(zhì)花生四烯酸通過環(huán)氧化酶和脂氧化酶兩條途徑分別生成前列腺E2及白三烯，后者刺激TNF-α、IL-8產(chǎn)生，進(jìn)而引起局部血管擴(kuò)張，通透性增加、滲出、水腫、白細(xì)胞聚集、發(fā)熱等炎癥反應(yīng)。TNF-α、IL-1β是炎癥網(wǎng)鏈中的一級細(xì)胞因子，而IL-8是由TNF-α、IL-1β誘導(dǎo)的二級前炎癥細(xì)胞因子［11］。大量實驗研究發(fā)現(xiàn)［12］，在尿酸鈉導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的實驗?zāi)Ｐ椭袡z測出TNFmRNA高表達(dá)，由于TNF可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的活性而使IL-1釋放，所以TNF在尿酸鈉結(jié)晶沉積中發(fā)揮重要作用，因此，TNF-α、IL-8作為炎癥反應(yīng)趨化因子和激活因子在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，并與疾病的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組大鼠比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度仍明顯增加，電針及雙氯芬酸鈉可明顯減輕模型大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，同時TNF-α、IL-8基因及蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組，說明電針能夠抑制大鼠炎癥細(xì)胞因子基因及蛋白表達(dá)，減輕局部炎癥，發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，電針治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效肯定，為其在臨床的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Mechanism Study of Electroacupuncture in Rats with Acute Gouty Arthritis

LI Yuebing，ZHANG Hong，LI Tielang，et al. College of Acupuncture&Moxibustion and Tui-na，Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China

Objective：To study the mechanism of action of electric acupuncture treatment in acute gouty arthritis.Methods：40 Wistar rats were randomly divided into the blank control group，the model group，the electric acupuncture group，the diclofenac sodium group with 10 rats in each group.Regular feeding was used in the blank control group，the remaining groups on uric acid sodium solution injections gouty arthritis rat model was established.Made 2 days before the mold and blank control group and model group give saline lavage，diclofenac sodium group diclofenac sodium solution to fill the stomach，electric acupuncture meridians to electric acupuncture group，each group were measured before and after the experiment rats ankle weeks diameter；Protein imprinting method，fluorescence，the protein and gene（quantitative PCR method to detect TNF-（expression of IL-8.Results：Compared with blank control group，model group rats ankle swelling degree increased significantly.The TNF-α and the IL-8 protein and gene expressions were significantly higher（P＜0.01）.Compared with model group，the curative group and diclofenac sodium group can obviously reduce the model rats ankle.The TNF-α and IL-8 protein and gene expressions were inhibited remarkably（P＜0.05，P＜0.01）.Compared with electric acupuncture group，there was no statistically significant difference double phenolic acid group（P＞0.05）.Conclusion：The curative effect of electric acupuncture in acute gouty arthritis can inhibit TNF-α and IL-8 gene and protein expressions in order to alleviate the inflammatory tissue damage.

Gouty arthritis；Electric acupuncture；TNF-α；IL-8

R245.9+7

A

1004-745X（2015）05-0781-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.05.010

2015-01-03）

湖南省教育廳科學(xué)基金項目（14C0855）