高效液相色譜法測(cè)定腦脈康顆粒中黃芪甲苷含量

萬萌萌，康新莉，譚睿，宋英，盛蓉

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都610031；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都610075）

高效液相色譜法測(cè)定腦脈康顆粒中黃芪甲苷含量

萬萌萌1，康新莉1，譚睿1，宋英2，盛蓉2

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都610031；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都610075）

目的建立測(cè)定腦脈康顆粒君藥黃芪中黃芪甲苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為30℃，流動(dòng)相為乙腈-水（36∶64），流速為1 mL/min。結(jié)果黃芪甲苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度線性范圍是0.035 4～0.354 2 g/L，線性回歸方程為logA=1.602 0 logCi+3.022 1，r2=0.999 9（n=8）；平均回收率為102.60%，RSD=2.96%（n=6）。結(jié)論該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于測(cè)定腦脈康顆粒君藥黃芪中黃芪甲苷的含量。

腦脈康顆粒；黃芪；黃芪甲苷；高效液相色譜法

腦脈康顆粒是由黃芪、丹參等藥材組方的復(fù)方制劑，黃芪為方中君藥，主要含有黃芪甲苷，故選擇黃芪甲苷作為控制制劑質(zhì)量的指標(biāo)成分。關(guān)于黃芪中黃芪甲苷的測(cè)定方法，已有報(bào)道的有薄層掃描法、超臨界萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析法、氣相色譜法、毛細(xì)管氣相色譜法、高效液相色譜（HPLC）法以及反相高效液相色譜法等?，F(xiàn)參考2010年版《中國藥典（一部）》［1］及相關(guān)文獻(xiàn)，建立了測(cè)定腦脈康顆粒中黃芪甲苷含量的HPLC法，為制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善與提高提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相色譜儀；Empower 2化學(xué)工作站，Waters 2424型蒸發(fā)光散射（ELSD）檢測(cè)器；Sartoius BS110型十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；腦脈康顆粒（批號(hào)分別為20120917，20120918，20120919），缺黃芪陰性樣品（批號(hào)為20120923），均由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供；黃芪甲苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)為110781-200613）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［2-10］

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（36∶64）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；ELSD參數(shù)：漂移管60℃，氣體壓力30 Psi，噴霧器加熱60%模式，增益20。

2.2 溶液制備

稱取黃芪甲苷對(duì)照品13.00 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得0.520 0 g/L的對(duì)照品溶液。精密量取樣品（批號(hào)為20120917）溶液10 mL共4份，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，收集正丁醇液，用1%NaOH溶液洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，在用正丁醇飽和的水溶液充分洗滌2次，每次40 mL，收集正丁醇萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。缺黃芪陰性樣品（批號(hào)為20120923），研細(xì)，取約5.2 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶液，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 KHz）30 min，放冷，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：精密吸取2.2項(xiàng)下種溶液各5 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液色譜中，黃芪甲苷色譜峰與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算不低于4 000，分離度大于1.5，陰性無干擾。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品（17.71 mg），置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得質(zhì)量濃度為0.708 4 g/L的黃芪甲苷對(duì)照品溶液。精密量取上述溶液0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，2.0，5.0 mL，分別配制成質(zhì)量濃度為0.035 4，0.042 5，0.049 6，0.056 7，0.063 8，0.070 8，0.141 7，0.354 2 g/L的黃芪甲苷對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積。以峰面積對(duì)數(shù)（log A）對(duì)質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)（log Ci）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程logA=1.602 0 logCi+3.022 1，r2=0.999 9（n=8）。結(jié)果表明，黃芪甲苷質(zhì)量濃度線性范圍為0.035 4～0.354 2 g/L。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果黃芪甲苷平均峰面積為6 134 335，RSD=1.44%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10 μL，于0，4，8，12，24 h時(shí)依法進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果黃芪甲苷平均含量為0.153 2 mg/g，RSD=5.28%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取樣品（批號(hào)為20120917）溶液10 mL，共6份，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果黃芪甲苷平均含量為0.153 2 mg/g，RSD=5.28%（n=6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收率試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為20120917）5 mL，共6份，分別精密加入對(duì)照品溶液（0.9 g/L）1 mL，按供試品溶液的制備方法制備溶液，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批中試樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

3 討論

2010年版《中國藥典（一部）》黃芪項(xiàng)下規(guī)定，黃芪飲片中黃芪甲苷含量不得少于400 μg/g，故3批樣品中黃芪甲苷的含量均符合要求。在含量測(cè)定試驗(yàn)中，丹參中的丹參酮ⅡA雖然為該復(fù)方制劑的主要成分之一，但是由于在黃芪為該方中的君藥，且黃芪甲苷的含量測(cè)定用到了ELSD，更具有指標(biāo)意義。故選用黃芪甲苷為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。在測(cè)定不同的3批樣品時(shí)，黃芪甲苷的含量變化不大，說明該測(cè)定方法具有良好的穩(wěn)定性。

參考藥典及相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合化合物的性質(zhì)，試用了色譜柱Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），結(jié)果分離度均良好，理論塔板數(shù)均大于5 000。本試驗(yàn)中選用Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。同時(shí)，考慮到ELSD的特點(diǎn)，溫度太低不利于檢測(cè)，試用柱溫30℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果分離度良好，樣品穩(wěn)定，故選用柱溫為30℃。選擇流動(dòng)相時(shí)，試用乙腈-水（32∶68）、乙腈-水（36∶64）、乙腈-水（40∶60），結(jié)果以乙腈-水（36∶64）為流動(dòng)相時(shí)黃芪甲苷峰峰形和保留時(shí)間較好。選擇ELSD參數(shù)時(shí)，根據(jù)儀器型號(hào)并參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇漂移管溫度60℃、氣體壓力30 Psi、噴霧器加熱60%模式、增益20為檢測(cè)條件，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷峰形、峰面積較佳，故采用此檢測(cè)條件。

表2 樣品中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：249.

［2］田南卉，楊國紅，方穎，等.高效液相色譜法蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定黃芪和制劑中黃芪甲苷的含量［J］.藥物分析雜志，2000，20（3）：199.

［3］段亞麗，謝梅冬.黃芪化學(xué)成分及其有效成分黃芪甲苷含量測(cè)定的研究現(xiàn)狀［J］.中國獸藥雜志，2005，39（3）：35-38.

［4］馮祚臻，俸小平，官東秀.黃芪甲苷的提取及含量測(cè)定研究進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)，2006，15（11）：80-82.

［5］胡芳弟，封士蘭，趙健雄，等.HPLC法測(cè)定黃芪中黃酮類成分和黃芪甲苷的含量［J］.分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2003，9（3）：173-177.

［6］蔡進(jìn)章，王增壽，章曉東.反相高效液相色譜法測(cè)定黃芪中黃芪甲苷的含量［J］.中國藥業(yè)，2004，12（12）：36-37.

［7］錢廣生，劉三康.HPLC測(cè)定黃芪注射液中黃芪甲苷的含量［J］.華西藥學(xué)雜志，2002，17（1）：41-42.

［8］郭洪祝.高效液相色譜法測(cè)定胰復(fù)康膠囊中黃芪甲苷含量［J］.中國中藥雜志，2000，25（10）：609-611.

［9］陳岳蓉，馬玲云，馬雙成.HPLC-ELSD測(cè)定芪鹿益腎片中黃芪甲苷的含量［J］.中國保健，2004（8）：629-631.

［10］馬艷蓉，劉泓，柴國林，等.HPLC—ELSD測(cè)定黃芪中黃芪甲苷含量及相關(guān)試驗(yàn)條件選擇的探討［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2004，17（6）：17-19.

［11］李飛，周洪雷，杜吳忱，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定心腦補(bǔ)益口服液中黃芪甲苷含量［J］.中國藥業(yè)，2011，20（5）：16-17.

Determination of AstragalosideⅣin Naomaikang Granules by HPLC

Wan Mengmeng1，Kang Xinli1，Tan Rui1，Song Ying2，Sheng Rong2
（1.Southwest Jiaotong University，Chengdu，Sichuan，China 610031；2.Teaching Hospital of Chengdu University of T.C.M，Chengdu，Sichuan，China610075）

ObjectiveTo establish a method for quality control of Naomaikang Granules.MethodsThe chromatography column was Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）.The mobile phase consisted of Acetonitrile-water（36∶64）at a flow rate of 1 mL/min，at 30℃. ResultsAstragaloside IV showed a good linear relationship within the range of 0.0354 mg/mL～0.354 2 mg/mL，equation of linear regression was logA=1.602 0 logCi+3.022 1，R2=0.999 9（n=8），the average recovery was 102.60%，RSD was 2.96%（n=6）. ConclusionThe methods are simple，exact and reproducible，and can be used for the qualitative and quantitative control of Naomaikang Granules.

Naomaikang Granules；milkvetch root；astragalosideⅣ；HPLC

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）20-0075-02

萬萌萌，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化和新制劑研發(fā)，（電子信箱）774235565@qq.com；譚睿，女，博士研究生，教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化和新制劑研發(fā)，本文通訊作者，（電話）028-87600993（電子信箱）tanrui@swjtu.edu.cn。

2015-03-25）