新型基因重組藻膽蛋白對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤突變型P53表達(dá)的影響

張曉平，張文平，侯林，田景振

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355；2.云南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，云南昆明650500）

新型基因重組藻膽蛋白對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤突變型P53表達(dá)的影響

張曉平1，張文平2，侯林1，田景振1

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355；2.云南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，云南昆明650500）

目的探討新型基因重組藻膽蛋白對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤突變型P53表達(dá)的影響。方法將小鼠腋下接種S180細(xì)胞荷瘤造模后，隨機(jī)分為陰性組，環(huán)磷酰胺組，新型基因重組藻膽蛋白組［50 mg/（kg·d）］，天然藻藍(lán)蛋白低、高濃度組［25，100 mg/（kg·d）］，共5組，陰性組給予等量生理鹽水，靜脈注射給藥11 d后處死，剝離腫瘤，采用免疫組化方法檢測(cè)腫瘤組織中突變型P53的表達(dá)。結(jié)果新型基因重組藻膽蛋白組，天然藻藍(lán)蛋白低、高濃度組突變型P53平均陽性表達(dá)率分別為12.28%，18.76%，15.80%，均低于陰性組的60.08%（P＜0.05）。結(jié)論新型基因重組藻膽蛋白可明顯抑制突變型P53表達(dá)（P＜0.05），可能對(duì)突變型P53表達(dá)有下調(diào)作用。

新型基因重組藻膽蛋白；突變型P53；表達(dá)

藻膽蛋白（phycobiliprotein）是主要來自真核藻類的一種捕光色素蛋白，在抗腫瘤、抗氧化等方面活性較高，有開發(fā)成為藥物的極大潛力［1］，新型基因重組藻膽蛋白可解決藥物開發(fā)過程中成本高、雜質(zhì)多、周期長(zhǎng)的問題。藻膽蛋白抗腫瘤功效已見大量報(bào)道［2-3］，但其抗腫瘤作用機(jī)制仍不明確。本研究中利用免疫組化方法研究新型藻膽蛋白與腫瘤密切相關(guān)的P53蛋白表達(dá)量的關(guān)系，并探討藻膽蛋白抑制腫瘤生長(zhǎng)的方式與途徑，為開發(fā)新的海洋藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試藥及儀器

動(dòng)物及瘤株：清潔級(jí)昆明小鼠50只，體重18～23 g，雄性，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)檢中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，動(dòng)物合格證編號(hào)SCXK（魯）20080002。小鼠S180實(shí)體瘤細(xì)胞，購(gòu)于上海市細(xì)胞研究所，采用常規(guī)方法小鼠體內(nèi)腹腔傳代。

藥品與試劑：新型基因重組藻膽蛋白（實(shí)驗(yàn)室自制）；藻藍(lán)蛋白從螺旋藻中提取（食品級(jí)螺旋藻粉，購(gòu)自江蘇賜百年公司）；注射用環(huán)磷酰胺（CY，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格為每瓶0.2 g）；蘇木色精（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；30%過氧化氫（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；兔抗小鼠P53多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；SABC試劑盒（包括生物素化山羊抗兔IgG 5%即用型BSA SABC工作液，武漢博士德生物工程有限公司）；DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

儀器：KD-202輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（浙江省金華市科技儀器設(shè)備有限公司）；生物圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)科技公司提供），OLYMPUS-BX50顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；ZMN-7803型自動(dòng)組織包埋機(jī)（常州華利電子公司）；Simple PCI圖像分析系統(tǒng)（V5.2，CompixInc，美國(guó)）。

1.2 方法

腫瘤動(dòng)物模型的建立［4］：將凍存的S180肉瘤細(xì)胞復(fù)蘇活化，并傳代4代。無菌抽取S180肉瘤小鼠腹腔積液，高壓滅菌，稀釋，以每只0.2 mL在小鼠腋下注射，24 h后隨機(jī)分5組。陰性組給予生理鹽水0.5 mL灌胃；新型基因重組藻膽蛋白組按50 mg/（kg·d）；天然藻藍(lán)蛋白按25，100 mg/（kg·d）分為高、低濃度組灌胃給藥，環(huán)磷酰胺組30 mg/（kg·d）腹腔注射，每日1次，連續(xù)給藥11 d。末次給藥24 h后，處死剝瘤。

免疫組化過程：將腫瘤放入固定液中保存，病理常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，切片滴加突變型P53多克隆抗體。將含腫瘤組織的的載玻片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后，用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，檸檬酸鹽微波15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，滴加正常BSA，置濕盒中37℃孵育20 min，甩凈液體，滴加突變型P53抗體（稀釋度為1∶150），4℃孵育過夜，滴加二抗生物素標(biāo)記二抗工作液40～50 μL，37℃濕盒內(nèi)孵育20 min，PBS清洗后滴加SABC工作液37℃濕盒中孵育20 min，加DAB充分顯色，顯色后蘇木精中復(fù)染2 min，處理，中性樹膠封片。

突變型P53表達(dá)的檢測(cè)：選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)分別計(jì)數(shù)約500個(gè)細(xì)胞，取陽性顯色平均數(shù)并評(píng)分。若著色較深定為2分，著淡色定為1分，基本上不著色定為0分。著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率≥51%為3分，26%～50%為2分，6%～25%為1分，≤5%為0分［5］。每張切片染色細(xì)胞的百分率得分染色程度的乘積為其最終得分。P53陽性細(xì)胞以細(xì)胞核著棕黃色為判定標(biāo)準(zhǔn)。

光鏡檢查：免疫組化后切片鏡檢，觀察各腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Simple PCI圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析，SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用F檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各用藥組小鼠S180實(shí)體瘤組織中P53表達(dá)與陰性組相比明顯減少（P＜0.05）；新型基因重組藻膽蛋白組與天然藻藍(lán)蛋白組相比明顯減少（P＜0.05），與環(huán)磷酰胺組相比差異不明顯（P＞0.05），結(jié)果見表1。突變型P53免疫組化主要在細(xì)胞核著色，呈棕黃色，或較淺的黃色。在顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)，陰性組細(xì)胞核在蘇木精復(fù)染后有一定程度的不規(guī)則現(xiàn)象，環(huán)磷酰胺組細(xì)胞核不規(guī)則程度較輕，新型基因重組藻膽蛋白組和天然藻藍(lán)蛋白組也有一定程度不規(guī)則性，結(jié)果見圖1。

表1 新型基因重組藻膽蛋白對(duì)突變型P53表達(dá)的影響

圖1 各組免疫組化P53顯微鏡下照片（×400）

3 討論

P53蛋白是一種基因調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)DNA受到損傷時(shí)其表達(dá)急劇增加，表達(dá)主要在細(xì)胞核。P53蛋白分為野生型和突變型，野生型半衰期較短，不易檢測(cè)，可使DNA受損，細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞分化而抑制腫瘤；而突變型半衰期長(zhǎng)，能引起細(xì)胞惡性增生和突變，使蛋白產(chǎn)物表達(dá)增加［6］，可用免疫組化方法檢測(cè)。本試驗(yàn)中即用該法檢測(cè)突變型P53的表達(dá)情況。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性組中突變型P53陽性表達(dá)率最高，符合預(yù)期，其他各組對(duì)于突變型P53的表達(dá)均有明顯的下調(diào)作用（P＜0.05），新型基因重組藻膽蛋白組、天然藻藍(lán)蛋白組均與陰性組有顯著性差異。環(huán)磷酰胺組對(duì)腫瘤抑制作用最明顯，其次是新型基因重組藻膽蛋白組，天然藻藍(lán)蛋白純度越高抑瘤效果越好。

新型重組藻膽蛋白能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與突變型P53的表達(dá)下調(diào)，減少其大量表達(dá)所造成的細(xì)胞分裂失去節(jié)制而使癌變?cè)黾?，同時(shí)減少P53突變所造成的細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)失去控制，及Bax/Bcl-2，F(xiàn)as/Apol，IGF-BP3等蛋白對(duì)凋亡作用的失控有關(guān)，從而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

［1］王庭健，林凡，趙方慶，等.藻膽蛋白及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［J］.植物生理學(xué)通訊，2006，42（2）：303-307.

［2］Manconia M，Pendás J，Ledón N，et al.Fadda Phycocyanin liposomes for topical anti-inflammatory activity：in-vitro in-vivo studies［J］.Journal of Pharmacy and Pharmacology，2009，61（4）：423-430.

［3］李冰，褚現(xiàn)明，高美華，等.鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（8）：1 045-1 050.

［4］吳蕾，龐廣昌，陳慶森.螺旋藻藻藍(lán)蛋白的規(guī)?；崛『蜕V純化技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2008，29（4）：461-463.

［5］陳智彬，宋永勝.Survivin、Caspase-3、突變型P53對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌預(yù)后的意義［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（3）：348-350.

［6］陸愛平，李吉友.DNA損傷修復(fù)能力、P53蛋白及增殖細(xì)胞核抗原在大腸癌發(fā)生過程中的變化［J］.中國(guó)腫瘤臨床，1997，2（12）：926-930.

Effect of New Recombinant Phycobiliprotein on Expression of P53 Mutant of Mice Treated with S180 Solid Tumor

Zhang Xiaoping1,Zhang Wenping2,Hou Lin1,Tian Jingzhen1
（1.Department of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong,China250355；2.Department of Pharmacy，Yunnan University of TCM,Kunming,Yunnan,China650500）

ObjectiveTo explore the effect of new recombinant phycobiliprotein on the expression of P53 in mutant of mice treated with S180 solid tumor.MethodsThe tumor-bearing mice which were inoculated with S180 solid tumor were randomly divided into 5 groups：model group,cyclophosphamide group,new recombinant phycobiliprotein group［50 mg/（kg·d）］,low,high dose of phycocyanin group［25,100 mg/（kg·d）］,the same amount of sodium chloride injection was given to model group.After the intragastric administration for 11 d,the mice were put to death and the solid tumor was removed from each group,and the expression of P53 mutant was detected by immunohistochemical SABC method.ResultsThe average positive expression rates of P53 mutant among new recombinant phycobiliprotein group,low,high dose of phycocyanin group were 12.28%，18.76%，15.80%respectively,which were much lower than 60.08%of the model group（P＜0.05）.ConclusionNew recombinant phycobiliprotein may decrease the expression of P53 mutant significantly,and may have down-regulatory effect on the expression of P53 mutant.

new recombinant phycobiliprotein；P53 mutant；expression

R285.5；R282.77

A

1006-4931（2015）20-0028-03

張曉平（1987-），女，博士研究生，主要從事新藥開發(fā)與中藥炮制原理研究工作，（電子信箱）xia_opingzhang@ 126.com；田景振，男，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾滤庨_發(fā)與中藥炮制原理研究，本文通訊作者，（電話）0531-89628597（電子信箱）tianjingzhen@163.com。

2014-11-13）