經(jīng)微酸性電解水處理的鮮切皇冠梨上的單增李斯特菌生長模型的建立

薩仁高娃，胡文忠，修志龍，姜愛麗，馮　可

（1.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600）

經(jīng)微酸性電解水處理的鮮切皇冠梨上的單增李斯特菌生長模型的建立

薩仁高娃1，胡文忠2，*，修志龍1，姜愛麗2，馮可1

（1.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600）

為了研究鮮活農(nóng)產(chǎn)品物流過程中單增李斯特菌（L.monocytogenes，LM）的生長動態(tài)并研發(fā)綜合防控技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)建立了經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上LM生長的初級模型。采用Matlab軟件擬合在經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上LM生長的Gompertz和Logistic模型，獲得了相應(yīng)的模型參數(shù)，即最大比生長速率（U）、延滯期（LPD）和最大細(xì)胞密度（MPD）。結(jié)果表明：LM在鮮切皇冠梨上可以生長；比較決定系數(shù)發(fā)現(xiàn)，除了26℃下，LM經(jīng)微酸性電解水處理的鮮切皇冠梨上的生長用Logistic模型能更好的擬合，其他均用Gompertz模型能更好的擬合本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)；微酸性電解水具有殺菌功效，和不處理組相比，LM在經(jīng)微酸性電解水處理后，減少了1.7 lg cfu/g；弱堿性電解水是一種具有保健功能的水，不具有殺菌作用。

單增李斯特菌，鮮切皇冠梨，酸性電解水，生長模型

李斯特菌（Listeria）是一種典型的胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性短桿菌，共分為2個群，7個種［1］。其中單增李斯特菌（L.monocytogenes，LM）被認(rèn)為是引起動物和人類李斯特菌病的主要致病菌［2］。從臨床表現(xiàn)來看，李斯特菌病能引起人和動物腦膜炎、敗血癥；引起妊娠感染，甚至導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)，熱性胃腸炎以及肝炎等，臨床死亡率高［3］?，F(xiàn)在，我國初步建立了LM的生長預(yù)測模型，大多數(shù)建立的是LM在營養(yǎng)肉湯、冷鮮畜禽肉及其肉制品上的生長預(yù)測模型［4-5］。國外對LM的研究很廣泛，建立了LM在新鮮果蔬、畜禽及其制品、水產(chǎn)品和乳制品上的生長模型［6-9］，但多數(shù)研究致力于國外市場上普遍存在的果蔬。皇冠梨是我國市場上常見的水果，存在被LM侵染的威脅，所以研究LM在鮮切皇冠梨上的生長情況及控制技術(shù)十分必要。國內(nèi)針對LM的控制技術(shù)研究也較少，主要有溫度、超高壓協(xié)同溫度處理［10］、溫度及氣調(diào)包裝［11］等物理控制技術(shù)。酸性電解水（Acidic electrolyzed water，AEW）是現(xiàn)今廣泛使用的殺菌液，制備方法是以離子交換膜電解食鹽水，在陽極即產(chǎn)生了酸性電解水。由于陽極產(chǎn)生的水含有高活性O(shè)2、Cl2、HClO及高濃度的氫離子，所以具有很強(qiáng)的氧化性，能有效地殺滅細(xì)菌［12］。電解食鹽水的同時，在陰極產(chǎn)生了弱堿性電解水，這是一種安全的保健水，可以調(diào)節(jié)人體酸堿度，維持體內(nèi)酸堿平衡，滲透性強(qiáng)，能將體內(nèi)代謝廢物帶出體外，可清除體內(nèi)的自由基，含有多種對人體有益的礦物元素，可降低血糖和血脂水平。但還沒有研究顯示其有殺菌功效?；诂F(xiàn)階段研究的局限性，本文建立經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上LM生長的初級模型，旨在為LM在鮮活農(nóng)產(chǎn)品物流過程中的動態(tài)變化及研發(fā)綜合防控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株LM標(biāo)準(zhǔn)菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株；0.1%蛋白胨水取1 g蛋白胨溶解于1000 mL蒸餾水中，校正pH至7.0后分裝到三角瓶和試管中，121℃高壓滅菌15 min，備用；含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE） 青島海博生物技術(shù)有限公司；牛津瓊脂（OXA）基礎(chǔ)青島海博生物技術(shù)有限公司，取5.85 g OXA，加熱溶解于100 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，冷至50℃時，加入1支牛津瓊脂添加劑（多粘菌素E 2 mg、放線菌酮40 mg、吖啶黃素0.5 mg、頭孢雙硫唑甲氧0.2 mg、磷霉素1 mg），混勻，傾入無菌平皿，備用；微酸性電解水（pH約為6.5）、弱堿性電解水（pH約為8.0） 由多功能電解制水機(jī)制得；無菌水蒸餾水121℃高壓滅菌15 min，冷卻，備用；Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、引物、ddH2O、10×PCR buffer、MgCl2、dNTP、Tag DNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1300系列A2型二級生物安全柜美國Thermo Fisher Scientific公司；HR40-IIA2二級生物安全柜青島海爾特種電器有限公司；MLS-3020型全自動高壓蒸汽滅菌器日本SANYO公司；BagMixer-400W型均質(zhì)器法國Interscience公司；AB135-S型分析天平瑞士METTLER TOLEDO公司；TGL-20M型高速臺式冷凍離心機(jī)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Acolsuper全自動菌落計(jì)數(shù)儀英國Synbiosis公司；TK7505型多功能電解制水機(jī)日本Panasonic公司；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HYC-326A型醫(yī)用冷藏箱青島海爾特種電器有限公司；YLE-1000型電熱恒溫水浴鍋北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司；Thermo Scientific Arktik熱循環(huán)儀美國Thermo Fisher Scientific公司；DYCP-31F型電泳儀北京市六一儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原菌液的制備在無菌室的生物安全柜里以無菌操作取TSA-YE斜面上的標(biāo)準(zhǔn)菌株，在TSA-YE無菌平板上平行劃線，36℃培養(yǎng)24～48 h活化。挑取單菌落接種于含有10 mL無菌TSB-YE的試管中，充分混勻，將試管放入36℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24～48 h，在4℃，5000×g條件下離心5 min后，棄去上清。沉淀用0.1%蛋白胨水沖洗，此過程在冰浴中進(jìn)行。沖洗后在4℃，5000×g條件下離心5 min，棄上清。重復(fù)上述沖洗過程3次，最終得到濃度約為107cfu/mL的菌懸液，即原菌液，4℃保存，備用［7］。

1.2.2樣品制備在無菌室內(nèi)，將皇冠梨用無菌水洗凈，再用醫(yī)用酒精將表面擦拭干凈。待酒精揮發(fā)后，用無菌刀將皇冠梨去皮、去核，切成0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm的小塊。均勻取400 g樣品，每100 g置于一個無菌容器中。分別接種10 mL濃度約為107cfu/mL的LM懸液于4個容器（1、2、3、4號）中的皇冠梨樣品上，充分混勻。所有接種樣品在生物安全柜中干燥1 h［7］。

1.2.3樣品處理在無菌室內(nèi)的生物安全柜里，分別加300 mL微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水于2、3、4號無菌容器中，攪拌浸泡15 min［13］，1號容器中的樣品作為對照，不處理。將對照組和處理組的樣品每10 g分裝在一個無菌均質(zhì)袋中，標(biāo)記后置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔一定時間取出相應(yīng)標(biāo)記的樣品，加入90 mL經(jīng)高壓滅菌的0.1%蛋白胨水，在拍擊式均質(zhì)機(jī)上連續(xù)均質(zhì)1 min，取上清菌懸液，用涂布平板培養(yǎng)法［14］計(jì)活菌數(shù)，平板用全自動菌落計(jì)數(shù)儀分析計(jì)數(shù)，其中每個處理做一個平行實(shí)驗(yàn)。

同樣方法將分裝好樣品的無菌均質(zhì)袋分別放入4℃和26℃培養(yǎng)，每隔一定時間取出相應(yīng)標(biāo)記的樣品，按上述方法處理，用平板涂布培養(yǎng)法計(jì)數(shù)，用全自動菌落計(jì)數(shù)儀分析。

1.2.4菌落驗(yàn)證挑取牛津瓊脂計(jì)數(shù)平板上有棕黑色暈環(huán)的可疑單菌落于TSA-YE平板上劃線純化，36℃培養(yǎng)24 h。挑取純化后的單菌落于5 mL TSB-YE培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液，同時加入50 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR，80℃熱變性30 min，低速離心30 s。將上清轉(zhuǎn)移至無菌離心管中作為PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)參照于旖斯等［15］的方法，LM的hlyA基因核苷酸序列設(shè)計(jì)引物：

hly-1：5’-GCCAGGTATGACTAATCAAGACAA-3’hly-2：5’-CGAAAAATCTGGAAGGTCTTGTAG-3’取0.2 mL離心管，分別加入29.5 μL ddH2O，5 μL 10×PCR buffer，4 μL MgCl2，4 μL dNTP，5 μL模板，1 μL hly-1，1 μL hly-2，0.5 μL Tag酶，低速離心30 s，置于PCR儀中，反應(yīng)條件為95℃3 min預(yù)變性，94℃30 s，51℃30 s退火，72℃30 s延伸，32個循環(huán)，72℃7 min，4℃保存，反應(yīng)體系為50 μL。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5初級模型構(gòu)建及統(tǒng)計(jì)分析建立Gompertz模型和Logistic模型，選擇最合適的模型得出LM在經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上的生長曲線，并得到相應(yīng)的初級模型參數(shù)。

式中：t表示時間（h）；Nt表示t時的菌數(shù)；A表示初始菌數(shù)N0（lg cfu/g）；C表示最大菌數(shù)Nmax與初始菌數(shù)N0的差值（lg cfu/g）；B為在時間點(diǎn)M時的相對最大生長速率（h-1）；M表示達(dá)到最大生長速率所需的時間（h）。

模型用Matlab軟件擬合，采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Microsoft Office Excel 2007作圖。

2　結(jié)果與討論

2.1初級模型的選擇

經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水、無菌水處理和未處理的鮮切皇冠梨上LM生長的Gompertz模型在不同溫度下的擬合很好，決定系數(shù)均在0.98以上，Logistic模型擬合較Gompertz模型差，均在0.91以上，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，除了26℃下，LM經(jīng)微酸性電解水處理的鮮切皇冠梨上的生長用Logistic模型能更好的擬合，其他均用Gompertz模型描述更好，因此，選用Gompertz模型建立初級模型。

2.2生長曲線

4、26和36℃下，Gompertz模型擬合的經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上的LM生長曲線見圖1～圖3。由圖1～圖3可知，LM在鮮切皇冠梨上可以生長，因?yàn)轷r切果蔬的加工操作（如去皮、切割及切片等）會使果蔬的組織結(jié)構(gòu)破壞、營養(yǎng)成分外流，極有利于微生物生長繁殖。LM在經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上生長情況不如未處理組，原因是稀釋作用導(dǎo)致單位體積菌數(shù)減少，初始菌數(shù)降低使LM生長受到影響，此結(jié)果與其他研究結(jié)果相同［16］；此外，殘留的處理液對LM的殺菌作用導(dǎo)致處理組生長情況不如未處理組。

圖1　4℃下Gompertz模型擬合的經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上的LM生長曲線Fig.1　Gompertz growth model of L.monocytogenes on fresh-cut pearsprocessedbysubacidityandalkalescenceelectrolysedwater，and sterile water at 4℃

圖2　26℃下Gompertz模型擬合的經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上的LM生長曲線Fig.2　Gompertz growth model of L.monocytogenes on fresh-cut pearsprocessedbysubacidityandalkalescenceelectrolysedwater，and sterile water at 26℃

圖3　36℃下Gompertz模型擬合的經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上的LM生長曲線Fig.3　Gompertz growth model of L.monocytogenes on fresh-cut pearsprocessedbysubacidityandalkalescenceelectrolysedwater，and sterile water at 36℃

表1　處理后的鮮切皇冠梨上LM生長的Gompertz模型和Logistic模型的決定系數(shù)（R2）Table 1　The coefficient of determination（R2）of Gompertz and Logistic model of L.monocytogenes on fresh-cut pears after processing

2.3初級模型的模型參數(shù)

由Matlab軟件擬合不同溫度下經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上的LM生長曲線，得到相應(yīng)的生長參數(shù)：最大比生長速率U（lg cfu/g·h）、生長延滯期LPD（h）和最大細(xì)胞密度MPD（lg cfu/g），結(jié)果見表2～表4。

可以看出在三個溫度下，最大比生長速率U（lg cfu/g·h）順序均為：微酸性電解水處理＞無菌水處理＞弱堿性電解水處理＞未處理（4℃下，0.0136＞0.0089＞0.0073＞0.0059；26℃下，0.1098＞0.0748＞0.0673＞0.0388；36℃下，0.1997＞0.1205＞0.1133＞0.1065），證明初始濃度越低，進(jìn)入對數(shù)期以后生長速度越快。

在三個溫度下，生長延滯期LPD（h）順序均為：未處理＞無菌水處理＞弱堿性電解水處理＞微酸性電解水處理（4℃下，53.7649＞50.2181＞44.2850＞15.5458；26℃下，6.3662＞5.5715＞4.9444＞1.1019；36℃下，4.6020＞2.5493＞2.3127＞0.8271），說明初始濃度越低，延滯期越短，越能較快進(jìn)入對數(shù)期，雖然無菌水處理的初始濃度比弱堿性電解水處理的初始濃度低，但無菌水處理的延滯期比弱堿性電解水處理的長，因?yàn)閮蓚€處理初始濃度很接近，所以延滯期長短也比較接近，還有可能因?yàn)槿鯄A性電解水中某些物質(zhì)對LM生長產(chǎn)生影響，使其延滯期縮短。

在三個溫度下，最大細(xì)胞密度MPD（lg cfu/g）的范圍是3.0934～4.2625 lg cfu/g，說明LM雖然能在皇冠梨上生長，由于受到營養(yǎng)物質(zhì)的限制，LM在皇冠梨上生長的MPD不能達(dá)到在營養(yǎng)肉湯中生長的MPD（4.0453～7.7709 lg cfu/g）［16］。

表2　4℃下Gompertz模型擬合的經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上的LM生長曲線的模型參數(shù)Table 2　Gompertz model parameters of L.monocytogenes on fresh-cut pears processed by subacidity and alkalescence electrolysed water，and sterile water at 4℃

表3　26℃下Gompertz模型擬合的經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上的LM生長曲線的模型參數(shù)Table 3　Gompertz model parameters of L.monocytogenes on fresh-cut pears processed by subacidity and alkalescence electrolysed water，and sterile water at 26℃

表4　36℃下Gompertz模型擬合的經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上的LM生長曲線的模型參數(shù)Table 4　Gompertz model parameters of L.monocytogenes on fresh-cut pears processed by subacidity and alkalescence electrolysed water，and sterile water at 36℃

從表2～表4可以看出，相同處理的LM在4℃下皇冠梨上的最大比生長速率小于在26℃的最大比生長速率（0.0136＜0.1098，0.0089＜0.0748，0.0073＜0.0673，0.0059＜0.0388），26℃的最大比生長速率小于36℃的最大比生長速率（0.1098＜0.1997，0.0748＜0.1205，0.0673＜0.1133，0.0388＜0.1065），證明隨著溫度升高，LM生長速度加快。

相同處理?xiàng)l件下，隨著溫度的升高，生長延滯期LPD（h）縮短。相同處理的LM在不同溫度下皇冠梨上生長延滯期順序?yàn)椋何⑺嵝噪娊馑幚恚?℃（15.5458）＞26℃（1.1019）＞36℃（0.8271），弱堿性電解水處理，4℃（44.2850）＞26℃（4.9444）＞36℃（2.3127），無菌水處理，4℃（50.2181）＞26℃（5.5715）＞36℃（2.5493），未處理，4℃（53.7649）＞26℃（6.3662）＞36℃（4.6020）。

從最大細(xì)胞密度MPD（lg cfu/g）可以看出，相同處理的LM在不同溫度下皇冠梨上生長的MPD均在一定范圍，即3.0934～4.2625 lg cfu/g，差異不顯著。

圖4　不同處理后LM的對數(shù)菌落數(shù)Fig.4　The number of colony of L.monocytogenes on fresh-cut pears by different cleaning processes

不同處理后LM的對數(shù)菌落數(shù)比較見圖4，可以看出，處理組比不處理組菌數(shù)減少，原因一是處理液的稀釋作用，二是處理液的殺菌功能。處理效果最好的是微酸性電解水，比不處理減少了1.7 lg cfu/g。其次是無菌水，比不處理減少了0.8 lg cfu/g。最后是弱堿性電解水，比不處理減少了0.7 lg cfu/g。由于處理組每100 g樣品加入處理液300 mL，攪拌浸泡后，稀釋造成菌濃度最大可降低約0.6 lg cfu/g，所以，微酸性電解水殺死的菌數(shù)最少約為1.1 lg cfu/g，具有殺菌功能（p＜0.05）。排除稀釋造成的菌數(shù)減少后，無菌水和弱堿性電解水比不處理組分別減少0.2和0.1 lg cfu/g，殺菌效果不顯著（p＞0.05）。

2.4PCR驗(yàn)證結(jié)果

PCR電泳鑒定見圖5，結(jié)果顯示，待檢樣品在350 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶，與LM陽性對照條帶位置一致。因此，可以確認(rèn)計(jì)數(shù)菌落是LM而非其他雜菌。

圖5　PCR電泳鑒定圖Fig.5　The chart of electrophoresis appraisal about PCR

3　結(jié)論

利用Matlab的函數(shù)資源，擬合了經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水處理的鮮切皇冠梨上LM生長的初級模型。本文分別擬合了Gompertz模型和Logistic模型，比較決定系數(shù)發(fā)現(xiàn)，Gompertz模型能更好的擬合本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微酸性電解水顯示了較好的殺菌功效（p＜0.05），而弱堿性電解水沒有殺菌作用（p＞0.05）。李華貞等［17］也研究了微酸性電解水殺滅LM的效果，結(jié)果也顯示了微酸性電解水對LM的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)基于目前國內(nèi)外LM生長預(yù)測模型研究的基礎(chǔ)，建立了鮮切皇冠梨上LM生長的初級模型，LM在鮮切皇冠梨上可以生長。同時，還建立了經(jīng)微酸性電解水、弱堿性電解水和無菌水三種處理的鮮切皇冠梨上LM生長的初級模型，為進(jìn)一步在鮮活農(nóng)產(chǎn)品上建立LM生長的二級模型和三級模型，研究其他鮮活農(nóng)產(chǎn)品物流過程中LM生長動態(tài)，研發(fā)綜合防控技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

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Growth model development of Listeria monocytogenes on fresh-cut pears treated with subacidity electrolyzed water

SAREN Gao-wa1，HU Wen-zhong2，*，XIU Zhi-long1，JIANG Ai-li2，F(xiàn)ENG Ke1
（1.College of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

The predictive model of contaminative fresh-cut pears processed by acidic electrolyzed water（AEW），alkalescence electrolyzed water and sterile water was established to research the growth dynamics of Listeria monocytogenes on fresh agriculture product in logistics process.The data were fit by Gompertz and Logistic model by Matlab software.Parameters from the models were observed，such as maximum specific growth rate（U），lag phase（LPD），maximum population density（MPD）.The result demonstrated that L.monocytogenes was able to grow on fresh cut pears.Logistic model showed that a high coefficient of determination for fresh-cut pears inoculated under subacidity electrolyzed water processing at 26℃，while the coefficient of determination of the Gompertz model was higher than that of Logistic model at 4 and 36℃.L.monocytogenes inoculated at fresh-cut pears could decrease 1.7 lg cfu/g by subacidity electrolyzed water processing.Disinfection ability of subacidity electrolyzed water was better than control sample.Alkalescence electrolyzed water had a certain healthcare function，it had not disinfection function.

Listeria monocytogenes；fresh-cut pears；electrolyzed water；growth modeling

TS201.3

A

1002-0306（2015）16-0328-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.058

2014－10－08

薩仁高娃（1987－），女，博士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：kuailexiaosa@sina.com。

胡文忠（1959-），男，博士，教授，研究方向：食品加工與質(zhì)量安全，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD38B05）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172009）；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012E13SF106）；大連市金州新區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-A1-049）。