竹茹多糖提取工藝優(yōu)化及其理化性質(zhì)分析

齊睿婷，黃菊青，高汪磊，張　英

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室，浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心，浙江杭州310058）

竹茹多糖提取工藝優(yōu)化及其理化性質(zhì)分析

齊睿婷，黃菊青，高汪磊，張英*

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室，浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心，浙江杭州310058）

以蒸汽爆破預(yù)處理后的竹茹為研究對象，采用水提醇沉法提取竹茹多糖，在單因素實驗基礎(chǔ)上進行正交實驗優(yōu)化粗多糖的制備，粗多糖經(jīng)過復(fù)溶、過濾、二次醇沉等處理純化得到精制竹茹多糖，并對其理化性質(zhì)進行分析測試。竹茹多糖提取的優(yōu)化工藝參數(shù)為：料液比1∶15（g/mL），提取溫度100℃，提取時間2.5 h，粗多糖得率為2.65%；粗多糖進一步精制獲得純度為80.75%的精制竹茹多糖（BSP），得率為2.25%。理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，BSP的化學(xué)組成主要有多糖（80.75%）、木質(zhì)素（5.45%）和酚酸（3.21%），BSP的單糖組成主要有木糖和葡萄糖，重均分子量約為7.6 ku，BSP水溶液為假塑性流體。

竹茹，多糖，分離制備，理化性質(zhì)

竹子是禾本科（Gramineac）竹亞科（Bambusoideae）多年生常綠植物。我國現(xiàn)有竹種39屬500余種，是世界上竹類資源最豐富的國家之一［1］。竹茹（Bamboo Shavings），為竹材加工的大宗副產(chǎn)物——“刮青”工藝削下的竹子外表皮部位，實為竹皮，據(jù)《中藥辭?！酚涊d，其為剛竹屬等一些竹種莖稈上刮下的外皮層或其次一層。作為臨床常用中藥之一，竹茹多用于胃熱嘔吐、胸膈煩悶等癥，但中醫(yī)藥對其成分和藥理的研究十分貧乏。近年來，國內(nèi)外對竹子次生代謝產(chǎn)物的研究和開發(fā)關(guān)注度不斷增強。除竹葉黃酮［2-3］外，多糖也是竹子中重要的生理活性成分，可作為廣譜免疫促進劑，還具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等多種生物學(xué)功效［4-5］。然而，目前研究主要集中在竹葉多糖［6-8］和竹筍多糖［9-10］上，對竹茹多糖的研究則幾近空白［11］。

我國是竹類資源大國，竹材加工過程中產(chǎn)生的大量竹茹常被遺棄，經(jīng)濟效益低，如何對其進行有效開發(fā)和綜合利用，已成為竹材加工企業(yè)關(guān)注的熱點。作為竹稈（木質(zhì)纖維素材料）的一部分，竹茹中的多糖成分主要為半纖維素。在植物細胞壁中，半纖維素與纖維素之間通過氫鍵或范德華力結(jié)合，與木質(zhì)素和蛋白質(zhì)之間通過化學(xué)鍵（酯鍵或醚鍵）連接，因此，半纖維素多糖較難被抽提出來。蒸汽爆破（簡稱汽爆），可使原料理化結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，將汽爆應(yīng)用于竹茹原料預(yù)處理后，竹茹多糖的得率顯著高于未處理組（p＜0.001）［12］。因此本文以汽爆處理后的竹茹作為研究對象，獲得精制竹茹多糖（Bamboo-shaving Polysaccharides，BSP），并對BSP的組成成分進行分析測試，以期為竹多糖的研究和開發(fā)找到更為合理的部位和高效的分離制備方法，也為竹材加工副產(chǎn)物的高值化利用提供新思路和新途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗原料毛竹（Phyllostachys Pubescens Mazel）的竹茹（Caulis Bamfusae in Taeniam）由浙江遂昌利民藥業(yè)提供；乙腈（99.9%） 德國默克化工技術(shù)（上海）有限公司；蘆?。?8%） 上海晶純生化科技股份有限公司；福林酚試劑、苯酚（≥99.5%），分子量為401300、76900、43500、10500、5000 u的葡聚糖標準品、α-D-葡萄糖（96%）、對羥基苯甲酸（99%）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，99%） 美國Sigma公司；考馬斯亮藍試劑盒南京建成生物工程研究所；0.22μm微孔濾膜（水系，聚四氟乙烯） 上海安普公司；其他試劑分析純。

3K-15離心機德國Sigma公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海申科機械研究所；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵上海豫康科技儀器設(shè)備有限公司；FD-1-50型冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；BSA124S-CW微量電子天平（0.00001） 瑞士賽多利斯公司；Spectrumlab 22pc型可見分光光度計上海光譜儀器廠；Waters2695高效液相色譜儀、Waters2996紫外檢測器，Waters515凝膠色譜儀、Waters2414示差折光檢測器美國Waters公司；ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱美國安捷倫公司；TSK-GEL G4000SWXL凝膠色譜柱日本TOSOH公司；MCR302旋轉(zhuǎn)流變儀奧地利安東帕有限公司；QBS-200B高密度蒸汽爆破機鶴壁市正道生物能源有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1竹茹原料預(yù)處理汽爆方法采用張英［12］的方法進行處理，自然風(fēng)干后備用。

1.2.2竹茹多糖的提取將經(jīng)汽爆處理后的竹茹原料用苯-乙醇（v/v，2∶1）混合溶劑進行熱回流脫蠟處理（80℃，6 h），于烘箱中烘干（60℃，16 h），備用。稱取500 g脫蠟后的原料，在一定料液比與溫度下，進行一定時間的熱回流提取，過濾后獲得浸提液，向濾液中緩慢加入4倍體積的無水乙醇（同時不斷攪拌），4℃下靜置12 h，收集沉淀，并用80%乙醇充分洗滌；將沉淀溶于40℃蒸餾水中，蒸去殘余乙醇，離心，取上清液，冷凍干燥，得到灰白色的竹茹多糖。

1.2.3單因素實驗設(shè)計

1.2.3.1料液比對多糖得率的影響固定提取溫度為100℃、提取時間為2.5 h，考察不同料液比（g/mL）1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30對多糖得率的影響。

1.2.3.2提取時間對多糖得率的影響固定提取溫度為100℃、料液比為1∶15（g/mL），考察不同提取時間1、2、3、4、5 h對多糖得率的影響。

1.2.3.3提取溫度對多糖得率的影響固定提取時間為2.5 h，料液比為1∶15（g/mL），考察不同提取溫度60、70、80、90、100℃對多糖得率的影響。

1.2.4正交實驗設(shè)計在單因素基礎(chǔ)上，以粗多糖得率為指標，通過L9（34）正交實驗對竹茹多糖提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，因素水平見表1。

表1　L9（34）正交實驗因素水平表Table 1　Factors and levers of L9（34）orthogonal design

1.2.5粗多糖得率的計算采用1.2.2方法提取得粗制的灰白色竹茹多糖，并以脫蠟后的竹茹原料（干基）為基礎(chǔ)計算竹茹粗多糖的得率：

1.2.6多糖純度測定采用苯酚-硫酸法，在Dobois M［13］的基礎(chǔ)上略作修改。準確配制0.25 mg/mL葡萄糖標準溶液，分別量取該溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL比色管中，蒸餾水補至2.0 mL，混勻，加入20 mg/mL苯酚試劑1.0 mL，濃硫酸試劑5.0 mL，立即搖勻，冷卻30 min，490 nm波長處測定吸光度，以吸光值為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線（得回歸方程）。取1.0 mg/mL樣品0.1 mL，蒸餾水補至2.0 mL，搖勻，空白用蒸餾水代替樣品，按照上述操作步驟，每組平行測試三次，從標準曲線中求取對應(yīng)的葡萄糖含量，并以換算因子0.9計算多糖含量，并計算多糖純度：

1.2.7粗多糖的精制參照俞泉宇［14］的方法略作修改。將上述得到的竹茹粗多糖用溫水（40℃）重新溶解（濃度約為100 mg/mL），8000 r/min離心10min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜（水系，聚四氟乙烯）后加入乙醇至終濃度為80%左右，置于（4±1）℃的冰箱中冷沉12 h，取沉淀，依次用95%乙醇、無水乙醇進行淋洗，洗至近無色，揮干溶劑后冷凍干燥得BSP。

1.2.8BSP的化學(xué)組成成分測定BSP的蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法［15］；BSP的酸可溶木質(zhì)素測定參照Wen J L［16］，酸不溶木質(zhì)素測定參照波欽諾克［17］；BSP的黃酮含量測定參照硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法［18］；BSP的酚酸含量測定參照福林酚試劑還原比色法［19］。

1.2.9BSP的單糖組成測定采用液相色譜法［20］。

1.2.10BSP的平均分子量測定采用凝膠過濾色譜法［21］。

1.2.11BSP溶液的黏度特性測定參照縱偉［22］的方法略作修改。配制5%的BSP水溶液，置于20℃和50℃水浴中保溫30 min后置于校正好的流變儀測定平臺，選擇直徑為25 mm的平板夾具，使平板與平臺間距為0.051 mm，啟動流變儀軟件中的旋轉(zhuǎn)測試模式，恒定溫度為20℃或50℃，設(shè)置剪切速率為0至25 min-1，啟動開始程序，待平板下降平穩(wěn)后刮去平板外多余樣品，繼續(xù)程序，測定BSP溶液的表觀黏度在不同溫度下隨剪切速率的變化曲線。

1.3統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均為三次測定結(jié)果的平均值，采用單因素方差分析（ANOVA）進行多組之間均數(shù)的差異性檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1竹茹多糖提取條件的優(yōu)化

2.1.1葡萄糖標準曲線測得葡萄糖標準曲線如圖1所示。由圖1可以看出，采用苯酚-硫酸法，葡萄糖在（25～250 μg/mL）質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與OD490值呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.0035x+0.0735（n=6，r= 0.9971）。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1　Standard curve of glucose

2.1.2料液比對竹茹粗多糖得率的影響從圖2可以看出，在提取溫度為100℃、提取時間為2.5 h時，隨著料液比從1∶10（g/mL）增加到1∶15（g/mL），多糖得率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)液料比達到1∶15（g/mL）時，多糖得率最高，為1.92%，而當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時，多糖得率為1.90%，與1∶15（g/mL）時多糖得率無顯著差異（p＞0.05），可知隨著料液比增加，多糖得率基本趨于平穩(wěn)，主要原因可能是該條件下多糖提取已較為充分，加大料液比，得率得不到顯著提高［9］。

2.1.3提取時間對竹茹粗多糖得率的影響圖3表明，在提取溫度為100℃、料液比為1∶15（g/mL）時，隨著提取時間從1 h增加到2 h，多糖得率顯著提高（p＜0.01），2 h時多糖的得率最高，為1.83%，超過2 h多糖得率反而有些下降，3 h多糖得率降為1.81%（p＞0.05），4 h多糖得率降為1.74%（p＜0.05），5 h多糖得率降為1.69%（p＜0.05）。這可能是因為，隨著提取時間的延長，部分多糖在高溫條件下發(fā)生降解，從而導(dǎo)致其得率的下降［14］。

圖2　料液比對竹茹粗多糖得率的影響Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of crude bamboo-shaving polysaccharides

圖3　提取時間對竹茹粗多糖得率的影響Fig.3　Effect of time on extraction yield of crude bamboo-shaving polysaccharides

2.1.4提取溫度對竹茹粗多糖得率的影響從圖4可以看出，提取溫度對多糖得率有較大影響，當(dāng)提取溫度從60℃上升到90℃，竹茹多糖得率隨溫度的升高而較大幅度增加。提取溫度達90℃時，竹茹多糖得率已較高，為1.84%，而提取溫度從90℃上升到100℃，多糖得率上升至1.858%，與90℃無顯著差異（p＞0.05），這可能是由于提取溫度的增加造成了部分糖苷鍵的斷裂，使部分多糖分解，導(dǎo)致提取出的多糖得率增幅趨于零［14，23］。

圖4　提取溫度對竹茹粗多糖得率的影響Fig.4　Effect of temperature on extraction yield of crude bamboo-shaving polysaccharides

2.1.5正交實驗結(jié)果與分析根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇提取溫度90℃，提取時間2 h、料液比1∶15（g/mL）為中間變量進行L9（34）正交實驗，實驗結(jié)果如表2所示。

表2　正交實驗結(jié)果Table 2　Results of orthogonal design

各因素對竹茹粗多糖得率的影響主次順序為：料液比＞提取溫度＞提取時間，優(yōu)化的水平組合為A2B3C3，即料液比1∶15（g/mL），提取時間2.5 h，提取溫度100℃。

在此優(yōu)化工藝下，重復(fù)實驗3次，測得竹茹粗多糖的平均得率為2.65%，純度為65.56%。根據(jù)1.2.7方法精制后，得到BSP的平均得率為2.25%，純度提高至80.75%。

2.2BSP的化學(xué)組成

對BSP的化學(xué)組成進行測定，結(jié)果如表3所示。從表中可看出，BSP多糖含量為80.75%；純化過程并未進行脫蛋白處理，蛋白質(zhì)含量只有0.71%，說明竹茹原料中蛋白含量較低；木質(zhì)素（酸不溶+酸可溶木質(zhì)素）含量占了5.45%，還含有3.21%的酚酸和少量黃酮（0.80%），所測組分合計為90.92%。

表3　BSP的組成（%）Table 3　Chemical composition of BSP（%）

2.3BSP的單糖組成

測得BSP的單糖組成如表4所示。由表4可以看出，BSP的單糖組成主要以葡萄糖和木糖為主，以葡萄糖醛酸摩爾濃度百分比記為1，換算得各單糖組成比例為：甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖=3.9∶1.0∶23.3∶1.9∶45.3∶1.5。

表4　BSP的單糖組成（摩爾濃度百分比）Table 4　Monosaccharide composition of BSP（molar concentration percentage）

從單糖組成分析，BSP主要由阿拉伯木聚糖和葡聚糖構(gòu)成。

2.4BSP的分子量及其分布

BSP的凝膠過濾色譜圖如圖5所示。精制BSP只呈現(xiàn)一個對稱峰，說明其純度較高，分子量分布也相對比較集中，通過軟件，得出平均分子量（Mw）約為7.6 ku。

圖5　竹茹多糖凝膠過濾色譜圖Fig.5　GFC profile of BSP

2.5BSP的黏度特性

測得BSP黏度特性如圖6所示。由圖6可以看出：a.從單一溫度下看，BSP溶液為假塑性流體，即隨剪切速率的提高，溶液的黏度呈現(xiàn)下降并最后平穩(wěn)的趨勢，這種現(xiàn)象稱為剪切稀化現(xiàn)象。這可能是因為在剪切力作用下多糖分子結(jié)構(gòu)被破壞，從而表現(xiàn)為多糖溶液黏度下降；b.從兩個溫度比較來看，隨著溫度升高，BSP溶液的黏度也呈下降趨勢。這可能是因為升溫過程使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，破壞了多糖分子側(cè)鏈間的氫鍵和離子鍵，多糖降為小分子糖而導(dǎo)致了黏度的下降，并且升溫也使得分子熱運動加快，分子間距離擴大，從而表現(xiàn)為多糖溶液黏度下降［22］。

圖6　剪切速度及溫度對5%BSP溶液黏度特性的影響Fig.6　Effect of temperature and shear rate on the viscosity of BSP

3　結(jié)論與討論

李義［9］報道了水提醇沉法提取毛竹筍多糖的最佳工藝，提取時間為4 h，并經(jīng)脫脂、Svage法去蛋白、過氧化氫溶液脫色等純化后竹筍多糖得率為0.32%（以鮮筍計，若按鮮筍含水量為80%估算，該竹筍多糖干基得率為1.6%）；俞泉宇等［14］借助超聲波輔助提取毛竹筍多糖，同樣經(jīng)過去蛋白、脫色等純化后竹筍多糖得率為2.948%（干基）、純度65.3%。周躍斌等［23］則用水提醇沉法研究了毛竹葉多糖，得率為0.661%（干基）；丁紅秀［24］用酶法處理后水提毛竹葉多糖，再經(jīng)膜過濾處理，得超濾竹葉多糖（純度為37.37%）和納濾竹葉多糖（純度為51.76%）。與上述源自于竹筍和竹葉部位的多糖相比，本研究發(fā)現(xiàn)，竹茹是竹多糖非常好的來源。與未經(jīng)蒸汽爆破的竹茹相比（多糖得率為0.56%，純度44.43%，數(shù)據(jù)未發(fā)表），經(jīng)過蒸汽爆破預(yù)處理后，竹茹多糖不僅制備工藝簡單（無需經(jīng)歷上述復(fù)雜純化步驟），且多糖得率高（精制多糖得率為2.25%）、雜質(zhì)含量少（純度在80%以上），可見蒸汽爆破是竹茹多糖提取的關(guān)鍵。

Sun等［25］將毛竹竿切成100 mm×15 mm×15 mm的塊狀，研究不同汽爆條件（2.0 MPa 5 min和1.8 MPa 5 min）處理后堿溶液提取對毛竹竿半纖維素多糖的影響，所得多糖平均分子量在4700～14050 u之間，主要由葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸6種單糖組成，以葡萄糖和木糖為主要單糖，與本研究所得BSP平均分子量約為7.6 ku，單糖組成相一致（BSP中含甘露糖而非半乳糖醛酸，也以葡萄糖和木糖為主要單糖），而本研究所得BSP中含有一定量的酚酸（3.21%），Sun等所得半纖維素多糖并不含有，主要是因為其堿液提取過程破壞了酚酸與多糖之間的酯鍵。

此外，本研究獲得的竹茹多糖在體外抗氧化活性方面并不比竹葉來源和竹筍來源的多糖差。如在對羥基自由基清除實驗中，在相同濃度下（2 mg/mL），丁秀紅［24］制備的竹葉多糖對羥基自由基清除率約為20%、俞泉宇等［14］制備的竹筍多糖對羥基自由基清除率約為15%，本研究獲得的竹茹多糖對羥基自由基清除率為15.26%（數(shù)據(jù)未發(fā)表），說明竹茹多糖抗氧化活性并不亞于竹葉多糖和竹筍多糖。

本研究獲得竹茹多糖提取的優(yōu)化工藝參數(shù)為：料液比1∶15（g/mL），提取溫度100℃，提取時間2.5 h。所得粗多糖得率為2.65%，精制竹茹多糖（BSP）得率為2.25%。理化性質(zhì)分析測試結(jié)果表明，BSP的化學(xué)組成主要由多糖（80.75%）、木質(zhì)素（5.45%）和少量酚酸（3.21%）組成，BSP的單糖組成主要由木糖和葡萄糖組成，重均分子量約為7.6 ku，BSP水溶液為假塑性流體。

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Extraction and physicochemical properties of the polysaccharides from bamboo shavings

QI Rui-ting，HUANG Ju-qing，GAO Wang-lei，ZHANG Ying*
（Zhejiang University，College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing，Zhejiang R&D Center for Food Technology and Equipment，Hangzhou 310058，China）

Steam explosion was applied in the pretreatment of bamboo shavings.Hot water extraction and ethanol precipitation were employed to extract the polysaccharides from steam-exploded bamboo shavings.Orthogonal test L9（34）was taken based on single-factor experiments to optimize the preparation of crude polysaccharides，which was further purified by redissolution，centrifugation and second ethanol precipitation to obtain the refined bamboo-shaving polysaccharides（BSP），and the physicochemical properties of BSP were analyzed.The extraction condition was optimized as follows：solid-liquid ratio 1∶15（g/mL），extraction time 2.5 h，extraction temperature 100℃.Under the condition，the yield of crude polysaccharides was 2.65%.Crude polysaccharides were further refined to get BSP with the purity being 80.75%，yield being 2.25%.Physicochemical analyses showed that，the main chemical composition of BSP was polysaccharide（80.75%），lignin（5.45%）and phenolic acid（3.21%），the main monosaccharide composition of BSP was glucose and xylose，with the average molecular weight being about 7.6 ku，and the solution of BSP was a kind of pseudoplastic fluid.

bamboo shavings；polysaccharides；extraction；physicochemical properties

TS209

B

1002-0306（2015）16-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.052

2014－09－15

齊睿婷（1990-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物與功能性食品，E-mail：474760103@qq.com。

張英（1961-），女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物與功能性食品，E-mail：yzhang@zju.edu.cn。

浙江大學(xué)馥莉食品研究院基金資助。