響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶提取瘤背石磺肌肉蛋白

刁　亞，沈和定，程知慶，姚理想，吳　欣，杜文俊

（上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶提取瘤背石磺肌肉蛋白

刁亞，沈和定*，程知慶，姚理想，吳欣，杜文俊

（上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

以瘤背石磺肌肉為原料，蛋白提取率為指標(biāo)，采用堿性蛋白酶提取瘤背石磺肌肉中的蛋白。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法考察溫度、pH、時(shí)間和液固比對蛋白提取率的影響，優(yōu)化堿性蛋白酶酶解反應(yīng)的工藝條件。結(jié)果表明，響應(yīng)面法得到的最佳工藝條件合理可行，最佳工藝條件為溫度56℃，pH12.6，時(shí)間3.2 h，液固比93 mL/g。在上述條件下，蛋白提取率的預(yù)測值為18.36%，實(shí)際值為18.30%，兩者相對誤差0.34%，表明此模型合理可行。

瘤背石磺，堿性蛋白酶，提取，響應(yīng)面

瘤背石磺（Onchidium struma）在江蘇沿海及上海又名土海參、海癩子、土雞等［1］，是軟體動(dòng)物門（Mollusc）腹足綱（Gastropoda）肺螺亞綱（Pulmonata）縮眼目（Stylommatophora）石磺科（Onchidiidae）的一種生物。瘤背石磺的身體表面分布著許多瘤狀突起，背部中間有一背眼，可以自由的伸縮，觸角頂端的眼沒有感光作用，是一種介于海洋和陸地之間的過渡帶海洋軟體動(dòng)物［1］。

從20世紀(jì)80年代中期開始，一些專家開始研究瘤背石磺的營養(yǎng)價(jià)值，管菊等［2］發(fā)現(xiàn)瘤背石磺肌肉蛋白含量高達(dá)59%，黃金田等研究表明瘤背石磺中人體必需氨基酸的含量較高，而其中谷氨酸和甘氨酸的比例為6.51%和4.77%［3］，瘤背石磺肌肉蛋白的營養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于其他動(dòng)物蛋白，使瘤背石磺在藥物和保健品開發(fā)中具有廣闊應(yīng)用前景［4］，所以合理利用瘤背石磺可溶性蛋白質(zhì)具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來許多研究學(xué)者采用酸法［5-6］、堿法［7-8］和酶法［9-12］提取動(dòng)物蛋白，進(jìn)一步分離純化得到活性肽。其中酶法過程條件容易控制，反應(yīng)條件溫和，成本低，效率高，是目前生產(chǎn)和科學(xué)研究中使用最廣泛的一種方法。蔣海萍等［13］比較了五種蛋白酶提取藍(lán)圓鯵蛋白的效果，選擇堿性蛋白酶作為制備藍(lán)圓鲹蛋白抗氧化肽的最佳蛋白酶。聶新艷等［14］采用胰蛋白酶提取雞爪外皮中的蛋白質(zhì)，通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝條件為預(yù)處理蒸煮時(shí)間為2 h、pH8.0、提取時(shí)間5 h、提取溫度46℃、加酶量100 U/g、液料比（v/w）為40∶1。祝海娟等［15］利用響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶提取大麥蟲蛋白的工藝，最佳條件為加酶量（E/S）5%、pH12、料液比1∶20 g/mL、提取溫度50℃、提取時(shí)間2.5 h，在此條件下得到大麥蟲蛋白的提取率為86.96%，大麥蟲蛋白含量75.01%。

本實(shí)驗(yàn)以瘤背石磺肌肉為原料，采用堿性蛋白酶進(jìn)行水解，考察不同的提取條件（溫度、pH、時(shí)間、液固比、加酶量）對蛋白提取率的影響，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，為酶法提取瘤背石磺肌肉蛋白提供理論依據(jù)，同時(shí)也為瘤背石磺資源利用提供重要參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

瘤背石磺2014年7月采于上海崇明島灘涂，經(jīng)上海海洋大學(xué)沈和定教授鑒定為瘤背石磺，平均體重為（17.81±3.29）g；胰蛋白酶（酶活力4.2×103U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力4.3×104U/g）、胃蛋白酶（酶活力1.2×103U/g）國藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶（酶活力2.1×104U/g）、堿性蛋白酶（酶活力2.0× 105U/g）北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、石油醚、磷酸、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅等均為分析純。

K12A型全自動(dòng)定氮儀上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司；HWS-26型雙列六孔恒溫水浴鍋上海慧泰儀器制造有限公司；AL104型電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UB-7 pH計(jì)梅特勒公司；DHG-9077A型電熱恒溫干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；QSJ-D162型組織切碎機(jī)廣東小熊電器有限公司；TDZ6B-WS型低速臺式離心機(jī)上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-7502PC型紫外可見分光光度計(jì)上海精密儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品制備將瘤背石磺解剖后取出內(nèi)臟，剩余肌肉組織用清水洗凈后裝袋，密封置于-80℃超低溫冷凍備用。

1.2.2粗蛋白含量測定粗蛋白測定采用微量凱氏定氮法（GB/T5009.5-2010），測得瘤背石磺肌肉粗蛋白含量為62.14%，與管菊等［3］的研究結(jié)果基本一致，表明瘤背石磺肌肉蛋白含量較多。

1.2.3水溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法［16］，蛋白提取率（%）=水解液中水溶性蛋白的含量/樣品粗蛋白的含量×100。

1.2.4瘤背石磺外套膜蛋白的酶解工藝?yán)鋬隽霰呈恰鈨觯?℃蒸餾水沖洗）→洗凈，瀝干→攪碎→石油醚去脂→乙醇洗滌→離心取沉淀物（4000 r/min，15 min）→40℃干燥12 h→沉淀物放入三角燒瓶→加入水（水與底物的質(zhì)量比以下稱液固比）→調(diào)節(jié)pH和溫度→加入蛋白酶→酶解（酶解過程不斷調(diào)節(jié)pH）→沸水浴10 min滅酶→離心分離取上清液（4000 r/min，15 min）→測定提取率。

1.2.5蛋白酶的選擇選用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶五種酶，按照文獻(xiàn)報(bào)道的最適作用條件［17-19］，比較這幾種酶對瘤背石磺肌肉蛋白的作用效果，表1為蛋白酶篩選條件。用考馬斯亮藍(lán)法測定并計(jì)算蛋白提取率。

表1　蛋白酶的篩選Table 1　Screening of protease

1.2.6單因素實(shí)驗(yàn)在時(shí)間2 h、pH12.0、液固比100∶1（mL/g）、加酶量5%的條件下，調(diào)整溫度為45、50、55、60、65、70℃，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察溫度對蛋白提取率的影響。

在溫度50℃、時(shí)間2 h、液固比100∶1（mL/g）、加酶量5%的條件下，調(diào)整pH為11.0、11.5、12.0、12.5、13.0和13.5，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察pH對蛋白提取率的影響。

在溫度50℃、pH12.0、液固比100∶1（mL/g）、加酶量5%的條件下，調(diào)整時(shí)間為1、2、3、4、5和6 h，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察時(shí)間對蛋白提取率的影響。

在溫度50℃、時(shí)間2 h、pH12.0、加酶量5%的條件下，調(diào)整液固比為50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1和100∶1（mL/g）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察液固比對蛋白提取率的影響。

在溫度50℃、時(shí)間2 h、pH12.0、液固比100∶1（mL/g）條件下，調(diào)整加酶量為5%、6%、7%、8%、9%和10%，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察加酶量對蛋白提取率的影響。

1.2.7響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對堿性蛋白酶酶解工藝進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取溫度、pH、時(shí)間和液固比4個(gè)因素進(jìn)行Box-Beknhen中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表2。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 2　Factors and levels of response surface experiences

1.2.8數(shù)據(jù)分析每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)平行三次，用Excel數(shù)據(jù)處理軟件求出平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。用SPSS分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)，利用Design expert 8.0.5.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1蛋白酶的酶解效果比較

五種酶對瘤背石磺肌肉蛋白提取效果如圖1。

從圖1中可以看出堿性蛋白酶對瘤背石磺蛋白的提取效果最好，提取率可達(dá)15.47%；胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的提取率分別為12.32%、11.81%、9.05%和8.33%。五種蛋白酶的提取率大小依次為堿性蛋白酶＞胃蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶＞木瓜蛋白酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瘤背石磺肌肉蛋白在較強(qiáng)酸性或較強(qiáng)堿性條件下易被水解，由于瘤背石磺的肌肉蛋白在普通條件下很難水解，而強(qiáng)酸和強(qiáng)堿打開了瘤背石磺肌肉蛋白的二級結(jié)構(gòu)，使其更容易被水解。堿性蛋白酶是一種由地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）產(chǎn)生的、具有廣泛底物特異性的絲氨酸型內(nèi)切蛋白酶［20］，現(xiàn)已成功用于青魚［21］、金槍魚［22］等魚蛋白的水解。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用水解效果更好的堿性蛋白酶進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖2可以看出，在溫度為45～55℃時(shí)，隨著溫度的提高，提取率增加，因?yàn)榈鞍追肿拥臒徇\(yùn)動(dòng)開始加強(qiáng)，平均動(dòng)能增高，酶與底物接觸的幾率不斷提高，底物的結(jié)構(gòu)也逐漸被打開。在55℃時(shí)蛋白提取率達(dá)到最大值，為14.8%，而溫度繼續(xù)升高，酶的穩(wěn)定性受到影響，蛋白開始變性，酶的活性降低，蛋白提取率開始下降，因此最適溫度為55℃左右。這與石嶺等［23］在堿性蛋白酶酶解草魚蛋白質(zhì)的研究中得到的最適溫度一致。

圖1　不同蛋白酶對瘤背石磺肌肉蛋白酶解效果Fig.1　The influence of different proteases on Onchidium struma mantle protein extraction

圖2　溫度對瘤背石磺肌肉蛋白提取率的影響Fig.2　Influence of temperature on Onchidium struma mantle protein extraction rate

2.2.2pH實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖3可以看出，當(dāng)pH在11.0～12.5時(shí)，酶空間的構(gòu)象隨著pH的變化而改變，從而影響酶蛋白分子中心的活性催化基團(tuán)與結(jié)合基團(tuán)的功能［24］，在pH為12.5時(shí)，酶的活性最強(qiáng)，因此蛋白提取率也最大，而繼續(xù)提高pH，酶的活性受到損失，甚至變性失活，蛋白提取率開始下降。這與徐鴻雁等［25］在蛹蟲草多肽的制備及分離研究中，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的最適pH12.0相類似。

圖3　pH對瘤背石磺肌肉蛋白提取率的影響Fig.3　Influence of pH value on Onchidium struma mantle protein extraction rate

2.2.3時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)間對蛋白提取率的影響如圖4。

圖4　時(shí)間對瘤背石磺肌肉蛋白提取率的影響Fig.4　Influence of enzymolysis time on Onchidium struma mantle protein extraction rate

由圖4可知，當(dāng)時(shí)間在1～3 h時(shí)，堿性蛋白酶持續(xù)水解底物，蛋白提取率不斷上升，酶解3 h，提取率達(dá)到最高，而時(shí)間繼續(xù)延長，由于酶解反應(yīng)基本完成，溶液達(dá)到了平衡狀態(tài)，溶液中的小肽和氨基酸開始增加［26］，導(dǎo)致蛋白提取率反而開始下降。這與劉淳等［27］在堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的研究中，堿性蛋白酶的最佳時(shí)間3 h相同。

2.2.4液固比實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖5可以看出，蛋白提取率隨著液固比的增加呈先上升后下降的趨勢，由于液固比較低時(shí)溶液的黏度較大，分子的擴(kuò)散速度較慢，因此提取率較低，隨著液固比的增加，分子擴(kuò)散速度提高，酶與底物的接觸機(jī)會(huì)提高，提取率提高，在90∶1 mL/g時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值，而液固比繼續(xù)增加，由于底物量變少，隨著溶劑的增加導(dǎo)致酶與底物接觸幾率降低，從而導(dǎo)致提取率下降。

2.2.5加酶量實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶添加過少，會(huì)影響酶解的效果，而酶添加過多，又會(huì)造成材料浪費(fèi)和成本的提高，因此必須確定經(jīng)濟(jì)合理的加酶量。由圖6可知，加酶量為5%～9%時(shí)，隨著酶濃度的增加蛋白提取率提高，而繼續(xù)添加酶會(huì)造成提取率的降低，這可能是因?yàn)槊搁_始催化水溶性蛋白的絲氨酸部位，產(chǎn)生小分子肽和氨基酸，造成蛋白提取率的下降［28］。因此為了生產(chǎn)考慮，選用9%的加酶量。這與唐寧等［29］在堿性蛋白酶制備玉米抗氧化肽的研究中，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的8%最適加酶量相類似。

圖5　液固比對瘤背石磺外套膜蛋白提取率的影響Fig.5　Influence of liquid-solid rate on Onchidium struma mantle protein extraction rate

圖6　加酶量對瘤背石磺肌肉蛋白提取率的影響Fig.6　Influence of enzyme amount on Onchidium struma mantle protein extraction rate

2.3響應(yīng)面設(shè)計(jì)最佳條件分析

2.3.1響應(yīng)面優(yōu)化因素選擇用SPSS對各個(gè)單因素進(jìn)行顯著性方差分析，選擇對瘤背石磺肌肉蛋白提取率影響較大的幾個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。通過比較可以得出溫度（A）、pH（B）、時(shí)間（C）和液固比（D）對瘤背石磺肌肉的提取率影響較大，選擇這四個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，其他因素取單因素實(shí)驗(yàn)中的最佳水平。

2.3.2響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果利用Design-Expert 8.0.5.0軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到蛋白提取率對溫度、pH、時(shí)間和液固比四個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=-640.32733+6.94523A+62.32167B+2.63933C+ 1.44330D+0.10000AB+0.03450AC+5.80000×10-3AD+ 0.09500BC-0.05600BD+0.04300CD-7.92570×10-2A2-2.49567B2-1.52017C2-6.45167×10-3D2

表3　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3　Design and results of response surface experiences

對上述模型進(jìn)行進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

由表4可知：回歸模型的p＜0.0001，說明模型極顯著，失擬項(xiàng)p=0.0872，不顯著（p＞0.05），并且該模型的確定系數(shù)R2為0.9721，模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj為 0.9441，說明此模型與實(shí)際擬合很好。

方差分析結(jié)果還表明，方程的一次項(xiàng)A、B、C、D影響極顯著（p＜0.01），交互項(xiàng)CD影響顯著（p＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響極顯著（p＜0.01），由此可見，溫度、pH、時(shí)間、液固比對響應(yīng)值都有顯著影響。

方差分析中各因素的F值可以反映各因素對于實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響大小，F(xiàn)越大，影響效果越大。從表4可知，F(xiàn)A（34.58）＞FC（29.49）＞FB（15.00）＞FD（11.85），因此各因素對于瘤背石磺外套膜蛋白提取率的影響大小順序依次是：溫度＞時(shí)間＞pH＞液固比。

2.4響應(yīng)面曲面分析及因素交互影響

通過上述方差分析的結(jié)果，僅有時(shí)間和液固比之間的交互作用有顯著性，做出交互項(xiàng)的3D曲面圖，如圖7所示。

由圖7可知，響應(yīng)面3D圖為開口向下的橢圓形曲面，當(dāng)時(shí)間一定時(shí)，蛋白提取率隨著液固比的增加呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢；而當(dāng)液固比一定時(shí)，蛋白提取率隨著時(shí)間的增加也同樣呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，說明無論時(shí)間過長或過短，液固比過大或過小都會(huì)對蛋白提取率造成一定的影響。從等高線呈橢圓可以看出時(shí)間與液固比的交互作用對蛋白提取率的影響較顯著，另外等高線沿時(shí)間軸向較液固比軸向密集，說明時(shí)間對蛋白提取率的液固比的影響大，等高線中心點(diǎn)為兩者的最優(yōu)值。

2.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design Expert 8.0.5.0軟件對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，得到的最優(yōu)工藝為：溫度55.88℃，pH12.62，時(shí)間3.21 h，液固比92.86 mL/g。在此條件下瘤背石磺肌肉蛋白提取理論值為18.36%?？紤]到實(shí)際需要，對上述最優(yōu)工藝進(jìn)行調(diào)整，確定最優(yōu)工藝為：溫度56℃，pH12.6，時(shí)間3.2 h，液固比93 mL/g，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次平行實(shí)驗(yàn)得到的瘤背石磺外套膜蛋白的實(shí)際平均值為18.30%，與模型的理論預(yù)測值（18.36%）較為接近，相對誤差為0.34%。

表4　回歸方程方差分析表Table 4　Analysis results of regression and variance

圖7　時(shí)間和液固比的交互作用對蛋白提取率的影響Fig.7　Response surface plots for the interactions effect of enzymolysis time and liquid-solid rate on the extraction rate of protein

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，分析了堿性蛋白酶對于瘤背石磺外套膜的提取效果，并進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取工藝條件。結(jié)果表明：影響堿性蛋白酶提取瘤背石磺外套膜蛋白的主要因素是溫度，其次是時(shí)間與pH，最后是液固比。根據(jù)回歸方程得到的最優(yōu)工藝為：溫度56℃，pH12.6，時(shí)間3.2 h，液固比93 mL/g，在此條件下得到最佳的蛋白提取率，提取率為18.30%。說明該模型可以很好地預(yù)測瘤背石磺外套膜蛋白提取條件與提取率之間的關(guān)系，同時(shí)也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝的可行性，從而為進(jìn)一步研發(fā)瘤背石磺提供了理論依據(jù)。

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Optimizing conditions for alkaline protease extraction of Onchidium struma mantle protein by response surface methodology

DIAO Ya，SHEN He-ding*，CHENG Zhi-qing，YAO Li-xiang，WU Xin，DU Wen-jun
（Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Shanghai Ocean University，Ministry of Education，Shanghai 201306，China）

The effect of alkaline protease on the rate of protein extraction of Onchidium struma mantle were studied. Then the enzymolysis conditions of alkaline protease were optimized by using response surface method（RSM）on the basis of single factor as temperature，pH value，time，liquid-solid rate and enzyme amount experiments. The results showed that the optimum enzymolysis conditions were optimized as following：temperature 56℃，pH value 12.6，time 3.2 h，liquid-solid rate 93 mL/g respectively.Under these conditions，the predicted protein extraction rate was 18.36%，compared to the measured value 18.30%，the relative error was 0.34%.Results showed that the conditions were reasonable and feasible.

Onchidium struma；alkaline protease；extration；response surface methodology

TS254.1

A

1002-0306（2015）16-0227-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.038

2014－12－03

刁亞（1990-），男，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源研究與開發(fā)，E-mail：diaoya2012@163.com。

沈和定（1964-），男，博士，教授，研究方向：貝類增養(yǎng)殖及海洋生物資源利用，E-mail：hdshen@shou.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41276157）；上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助。