金針菇tps1基因序列分析及不同溫度下tps1、tps2基因定量表達(dá)研究

劉建輝，張俊玲，李　　亮，尚曉冬，*，譚　　琦，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海201403）

金針菇tps1基因序列分析及不同溫度下tps1、tps2基因定量表達(dá)研究

劉建輝1，2，張俊玲2，李亮1，2，尚曉冬2，*，譚琦1，2，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海201403）

研究探討金針菇海藻糖合成相關(guān)酶基因及其功能，為進(jìn)一步揭示其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的變化規(guī)律奠定基礎(chǔ)。本研究對(duì)金針菇6-磷酸海藻糖合成酶基因tps1的序列進(jìn)行分析，并以金針菇孢子單核體菌株Dan3為實(shí)驗(yàn)材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比較了tps1、tps2基因在不同溫度變化下金針菇中的相對(duì)表達(dá)量差異。結(jié)果表明，金針菇tps1基因cDNA序列包含1455 bp的ORF，編碼1個(gè)由484個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；對(duì)其起始密碼子上游2000 bp調(diào)控區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)具有典型的熱激反應(yīng)元件（HSE，C4T）和壓力反應(yīng)元件（STRE，AG4）等調(diào)控元件；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組21℃處理，37℃高溫及4℃低溫處理2 h后，tps1、tps2基因相對(duì)表達(dá)量均有顯著（p＜0.05）升高。說(shuō)明tps1、tps2基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到溫度調(diào)控。

金針菇，溫度，tpst1，tps2，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，生物信息學(xué)

海藻糖由兩個(gè)吡喃環(huán)葡萄糖分子通過(guò)1，1-糖苷鍵連結(jié)而成，是一種穩(wěn)定的非還原性二糖。在生物體內(nèi)，它是一種典型的應(yīng)激代謝產(chǎn)物，能夠作為一種高效保護(hù)物質(zhì)，幫助細(xì)胞成分抵抗外界不利條件。當(dāng)生物體生長(zhǎng)環(huán)境良好時(shí)，體內(nèi)不積累海藻糖；而當(dāng)生物體處于脅迫環(huán)境（如低溫或干旱）時(shí)，體內(nèi)就會(huì)迅速積累海藻糖［1-2］，保護(hù)多種生物大分子，從而保護(hù)生命本身［3-4］，而且這些海藻糖會(huì)隨著不良環(huán)境的解除而被降解。真菌中海藻糖代謝主要有兩個(gè)途徑：TPP/TPS［5］和TreP［6］途徑。6-磷酸海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，Tps1）與6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（Trehalose-6-phosphate phosphatase，Tps2）是真菌中海藻糖合成途徑—TPP/TPS途徑中所涉及到的合成酶。編碼Tps1和Tps2兩種酶的基因分別為6-磷酸海藻糖酶基因（tps1）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶基因（tps2）。其中Tps1是海藻糖合成反應(yīng)的關(guān)鍵酶，不僅作為代謝酶，也作為壓力調(diào)控者［7］，其調(diào)控基因tps1的啟動(dòng)子序列中含有代謝調(diào)控元件。張芳［8］通過(guò)對(duì)南極低溫酵母Guehomyces pullulans 17-1菌株中的tps1基因分析發(fā)現(xiàn)，在它的啟動(dòng)子中存在2個(gè)熱激反應(yīng)元件（HSE）和1個(gè)壓力反應(yīng)元件（STRE）的核心序列，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)G.pullulans 17-1菌株處于高溫、低溫逆境環(huán)境時(shí)，tps1基因也會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，幫助細(xì)胞抵御不良環(huán)境的影響。

金針菇（Flammulina velutipes（Fr.）Sing）學(xué)名毛柄金錢菌，屬傘菌目，口蘑科，金錢菌屬［9］。金針菇營(yíng)養(yǎng)豐富，是我國(guó)工廠化生產(chǎn)規(guī)模最大的食用菌。金針菇的生長(zhǎng)發(fā)育需要受到復(fù)雜的外界脅迫及調(diào)控，而海藻糖具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)天然構(gòu)象和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性的生物學(xué)功能，在逆境脅迫下，真菌體內(nèi)積累大量海藻糖［10-11］。金針菇菌絲生長(zhǎng)溫度為19～21℃，而原基的誘導(dǎo)需要搔菌處理及相應(yīng)的低溫刺激。探究其生長(zhǎng)發(fā)育期間海藻糖合成相關(guān)酶的代謝調(diào)控情況，有助于理解金針菇生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化與能量利用、代謝情況及現(xiàn)原基、子實(shí)體生長(zhǎng)的作用機(jī)制，從而了解其抗逆機(jī)制及對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制。1988年，在金針菇中首次發(fā)現(xiàn)TreP途徑中的海藻糖磷酸化酶（trehalose phosphorylase，TP）［12］。但是目前尚未有金針菇中TPP/TPS途徑海藻糖合成相關(guān)基因的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)金針菇的全基因組序列信息，首次得到海藻糖合成代謝調(diào)控途徑中涉及的tps1基因與tps2基因序列，針對(duì)關(guān)鍵基因tps1的特征序列及其上游序列的調(diào)控元件進(jìn)行了分析，并在此分析基礎(chǔ)上探究了在不同溫度下金針菇孢子單核體Dan3菌株tps1、tps2的定量差異，以期獲得溫度變化下金針菇海藻糖合成酶基因的變化，為金針菇中海藻糖的代謝及相關(guān)酶基因調(diào)控的研究提供理論依據(jù)，為揭示其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的抗逆機(jī)制及對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，從而進(jìn)一步指導(dǎo)金針菇的栽培工藝。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

金針菇孢子單核體菌株Dan3由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心提供；Taq DNA Polymerase in Storage Buffer B、pGM?-T Ligation Kit、感受態(tài)細(xì)胞DH5α天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMIITaKaRa公司；AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit、質(zhì)粒小量制備試劑盒AXYGEN愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；Redzol試劑盒北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；PDB馬鈴薯葡萄糖肉湯碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基青島生工生物科技有限公司；其他試劑均為市售，分析純；PDA培養(yǎng)基馬鈴薯提取物200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 L，121℃滅菌15 min；馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基按照說(shuō)明書配制。

5810R型高速冷凍離心機(jī)Eppendorf公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；制冰機(jī)美國(guó)格蘭特公司；超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-1800島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)日本SHIMADZU公司；EC3 Imaging System凝膠成像系統(tǒng)SYNGENE公司；PCR擴(kuò)增儀TaKaRa公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀Applied Biosystems公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1金針菇菌絲的培養(yǎng)與溫度處理將金針菇孢子單核體Dan3的菌絲轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上，置于21℃恒溫培養(yǎng)8 d。將長(zhǎng)滿菌絲的培養(yǎng)基加入勻漿器中打碎，按照10%的接種量轉(zhuǎn)接入100 mL PDB培養(yǎng)液中，置于21℃條件下，120 r/min，培養(yǎng)6 d。將培養(yǎng)好的金針菇菌絲分別在37℃與4℃下處理2 h，以21℃正常溫度下培養(yǎng)2 h的菌絲作為對(duì)照。每組處理設(shè)置5個(gè)平行，處理后過(guò)濾收集菌絲，液氮凍存后備用。

1.2.2菌絲體總RNA的提取和cDNA的合成參照Redzol試劑盒說(shuō)明書提取金針菇菌絲體總RNA，并用DEPC預(yù)處理的水溶解，進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。測(cè)定RNA的濃度，依據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說(shuō)明書，去除基因組DNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3金針菇tps1基因同源物搜索與生物信息學(xué)分析根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的金針菇全基因組序列信息，構(gòu)建本地Blast數(shù)據(jù)庫(kù)，使用擔(dān)子菌中已知的Tps1基因序列在全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中運(yùn)行blastn搜索，獲取相應(yīng)的Scaffold片段核苷酸序列；進(jìn)行同源性比較，在NCBI中通過(guò)BlastX，獲取與金針菇同源性高且物種相近的核苷酸比對(duì)結(jié)果，根據(jù)真核生物去除內(nèi)含子的原則（GT-AG原則），去除核苷酸序列中可能的內(nèi)含子序列，內(nèi)含子序列長(zhǎng)度通常在30～100 bp之間；在NCBI中再次BlastX，獲取金針菇中該蛋白可能的核苷酸保守序列。采用NCBI的ORF Finder程序預(yù)測(cè)tps1基因的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）；Genetyx對(duì)堿基序列進(jìn)行氨基酸翻譯分析；使用ExPASy ProtParam在線分析工具預(yù)測(cè)Tps1蛋白的理化性質(zhì)、分子量、等電點(diǎn)；利用SWISS-Model預(yù)測(cè)和模擬草菇Tps1蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；多序列比對(duì)由Clustalx完成。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

1.2.4.1目的基因編碼區(qū)的獲取根據(jù)所獲得的tps1基因的核苷酸編碼區(qū)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物（表1），由上海生工生物公司合成。以GPD（3-磷酸-甘油酯脫氫酶）gpd基因作為內(nèi)參基因，采用常規(guī)PCR擴(kuò)增tps1和gpd基因片段，并構(gòu)建用于real-time PCR實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，具體方法參照汪虹與陳明杰［13］的方法。

1.2.4.2Real-time PCR反應(yīng)將含有內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒依次進(jìn)行10倍稀釋，得到5個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品濃度，在StepOne Plus熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將所得數(shù)據(jù)按ΔΔCT法計(jì)算tps1基因的相對(duì)表達(dá)量［14-15］。Real-time PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，10 μmol/L forward primer 0.4 μL，10 μmol/L reverse primer 0.4 μL，50×Rox 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性20 s，1個(gè)循環(huán)；95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s，該過(guò)程進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每組樣品設(shè)置4個(gè)平行樣品孔，并設(shè)置無(wú)菌雙蒸水代替模板作為陰性對(duì)照。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 19.0進(jìn)行單因素方差分析，不同小寫字母表示差異達(dá)到顯著水平（p＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用OriginPro 8軟件作圖分析。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物Table 1　Primers used for real-time PCR

2　結(jié)果與分析

2.1生物信息學(xué)分析

2.1.1金針菇tps1基因結(jié)構(gòu)的分析本文首次獲得了金針菇中Tps1酶基因序列的全長(zhǎng)，命名為FVTPS1，并提交到了Genbank（登錄號(hào)：KP192934）。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：根據(jù)內(nèi)含子保守性連接序列（GTAG原則），推斷出所獲得tps1基因的DNA序列編碼區(qū)長(zhǎng)度為1956，含有2個(gè)內(nèi)含子（49、52 bp），cDNA序列全長(zhǎng)為1855 bp，包含1455 bp的ORF，編碼1個(gè)由484個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)（圖1）。

對(duì)金針菇Tps1起始密碼子上游2000 bp調(diào)控區(qū)域進(jìn)行分析（表2），該區(qū)域分布除有TATA-box、CAAT-box外，還存在防衛(wèi)和脅迫響應(yīng)元件（TC-rich repeats）、干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS）、熱激反應(yīng)元件（HSE）和壓力反應(yīng)元件（STRE）等調(diào)控元件，預(yù)示金針菇Tps1編碼基因的轉(zhuǎn)錄可能會(huì)受到干旱、熱激等外界脅迫作用的影響。

表2　金針菇tps1基因啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控元件分布Table 2　Distribution of putative regulatory elements in the promoter regions of Flammulina velutipes tps1 gene

圖1　tps1基因cDNA序列及編碼的氨基酸序列Fig.1　Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of tps1 gene

2.1.2金針菇Tps1氨基酸序列分析利用Protparam軟件進(jìn)行在線分析，結(jié)果預(yù)測(cè)所編碼蛋白Tps1的分子量為54.30 ku，等電點(diǎn)為5.71，有酸性氨基酸56個(gè)，堿性氨基酸44個(gè)，理論半衰期大于20 h，不穩(wěn)定指數(shù)為42.80，屬于不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。經(jīng)Blast同源性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)序列與多種真菌的TPS1具有很高的同源性（圖2），與雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor S238NH82，XP_001880689.1）、糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus PC15，KDQ24640.1）、灰蓋鬼傘（Coprinopsis cinerea okayama7#130，XP_001836488.2）、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus var.bisporus H97，XP_006459234.1）、褐腐菌（GloeophyllumtrabeumATCC11539，XP_007868722.1）、的同源氨基酸序列相似性分別達(dá)到了89%、88%、89%、87%、85%，表明金針菇的Tps1較為保守。

圖2　金針菇Tps1與其它真菌同源氨基酸序列比對(duì)Fig.2　Sequence alignment between Tps1 from Flammulina velutipes and other homologous sequences from different fungi

利用SWISS-Model預(yù)測(cè)和模擬了金針菇tps1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）。參考模板為α，α-trehalosephosphate synthase蛋白（PDB：1uqu.1.A），且兩者的氨基酸序列相似性達(dá)到了33.10%。

圖3　SWISS-Model模擬金針菇Tps1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3　Structure prediction of Tps1 from Flemmulina velutipes by SWISS-Model

2.2不同溫度下金針菇單3菌株中tps1、tps2基因表達(dá)變化分析

2.2.1RNA提取由圖4可見(jiàn)，28S、18S處條帶清晰明亮，總RNA完整無(wú)降解。經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)OD值均在1.7～1.9之間，總RNA純度較高，濃度均符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

2.2.2PCR反應(yīng)產(chǎn)物PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量。從圖5可以看出：tps1、tps2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后條帶單一，無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，大小與預(yù)期片段相符。切膠回收目的片段，轉(zhuǎn)化入質(zhì)粒，測(cè)序分析，與本實(shí)驗(yàn)室金針菇全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的tps1、tps2基因序列比對(duì)，同源性100%，確定產(chǎn)物為目的片段，引物符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖4　總RNA電泳結(jié)果Fig.4　Agarose gel electrophoresis of the total RNA

圖5　目的基因PCR電泳圖Fig.5　Agarose gel electrophoresis of target gene

2.2.3Real-time PCR圖6是tps1、tps2基因擴(kuò)增后的溶解曲線，分別在84.97、82.3℃時(shí)出現(xiàn)單一峰，表明tps1、tps2基因擴(kuò)增具有特異性，tps1、tps2基因相對(duì)定量的結(jié)果可信。

不同溫度處理下金針菇Dan3菌株的tps1和tps2基因經(jīng)real-time PCR后得到CT值，并采用ΔΔCT法計(jì)算tps1、tps2基因的相對(duì)表達(dá)量（表3、表4）。金針菇Dan3菌絲受37℃相對(duì)高溫及4℃相對(duì)低溫處理2 h之后，相對(duì)于對(duì)照組（21℃處理），tps1基因與tps2基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著（p＜0.05）上升。這與Fang Zhang等［16］的研究結(jié)果較為接近，當(dāng)G.pullulans 17-1菌株處于25℃高溫培養(yǎng)下，菌體內(nèi)海藻糖含量、TPS酶活及tps1基因的相對(duì)表達(dá)量明顯升高。而劉秀明［17］在研究肺形側(cè)耳菌絲體內(nèi)海藻糖合成代謝相關(guān)基因時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)，tps1、tps2的mRNA表達(dá)水平都受高溫脅迫的影響，其中高溫脅迫處理6 h，tps1基因的mRNA開始急劇增加；而tps2基因也高效表達(dá)，表達(dá)量增加。對(duì)tps1基因來(lái)說(shuō)，37℃處理組基因表達(dá)量升高至21℃對(duì)照組的22.22倍，而4℃處理組的表達(dá)量升高至21℃對(duì)照組的11.71倍。對(duì)tps2基因來(lái)說(shuō)，37℃處理組基因表達(dá)量升高至21℃對(duì)照組的5.99倍，而4℃處理組的表達(dá)量升高至21℃對(duì)照組的6.99倍。

圖6　tps1、tps2基因擴(kuò)增熔解曲線Fig.6　Melt curve of tps1，tps2 gene

表3　不同溫度處理下金針菇Dan3菌絲中tps1基因相對(duì)表達(dá)量Table 3　Relative expression of tps1 gene under different temperature stress in mycelia of Dan3

表4　不同溫度處理下金針菇Dan3菌絲中tps2基因相對(duì)表達(dá)量Table 4　Relative expression of tps2 gene under different temperature stress in mycelia of Dan3

3　結(jié)論與討論

本研究首次獲得了金針菇中的tps1基因序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過(guò)對(duì)金針菇tps1基因起始密碼子上游2000 bp調(diào)控區(qū)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)含有TATA-box、CAAT-box、防衛(wèi)和脅迫響應(yīng)元件、干旱脅迫響應(yīng)元件、熱激反應(yīng)元件和壓力反應(yīng)元件等調(diào)控元件，所以推測(cè)金針菇Tps1基因的轉(zhuǎn)錄可能會(huì)受到干旱、熱激等外界脅迫作用的影響。據(jù)此推測(cè)，本文以溫度刺激為切入點(diǎn)，以本實(shí)驗(yàn)室育得的金針菇Dan3菌株為實(shí)驗(yàn)材料，研究了溫度脅迫對(duì)金針菇中海藻糖的合成代謝途徑所涉及的關(guān)鍵基因tps1、tps2基因表達(dá)的影響。

tps1和tps2基因都具有合成海藻糖的催化活性。金針菇菌絲的正常培養(yǎng)溫度為19～21℃，而在高溫37℃、低溫4℃脅迫作用下，調(diào)控海藻糖合成的tps1和tps2基因的表達(dá)量都顯著上升（p＜0.05），說(shuō)明tps1和tps2基因在轉(zhuǎn)錄水平上受到溫度的顯著影響（p＜0.05），而溫度變化可能是通過(guò)影響tps1和tps2基因表達(dá)量，進(jìn)而影響酶活；而海藻糖含量可能也會(huì)增加，啟動(dòng)脅迫應(yīng)答機(jī)制，幫助細(xì)胞成分抵抗外界不利條件，保護(hù)生物大分子。通過(guò)對(duì)金針菇tps1基因的序列分析及溫度變化下tps1、tps2基因表達(dá)量變化的研究，將有助于深入了解金針菇的溫度脅迫應(yīng)答機(jī)制，探究其變化機(jī)理，從而得到金針菇的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制，那么改善栽培工藝、縮短生長(zhǎng)周期、提高生產(chǎn)質(zhì)量也將成為可能。本文僅研究了金針菇海藻糖代謝中的合成途徑相關(guān)酶基因的定量表達(dá)，而海藻糖的代謝調(diào)控十分復(fù)雜，還需要對(duì)其他海藻糖代謝調(diào)控相關(guān)酶及基因以及其在不同溫度脅迫下的變化進(jìn)行研究，才能進(jìn)一步了解金針菇中海藻糖的代謝調(diào)控機(jī)制，為揭示金針菇生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的抗逆機(jī)制及對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。

［1］André Van Laere.Trehalose，reserve and/or stress metabolite？［J］.Fems Microbiology Letters，1989，63（3）：201-210.

［2］Wiemken A.Trehalose in yeast，stress protectant rather than reserve carbohydrote［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，1992，58（3）：209-217.

［3］Hounsa CG，Brandt EV，Thevelein J，et al.Role of trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress［J］. Microbiology，1998，144：671-680.

［4］Purvis JE Yomano LP，Ingram LO.Enhanced trehalose production improves growth of Escherichia coli under osmotic stress［J］.Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：3761-3769.

［5］De Smet KA，Weston A，Brown IN，et al.Three pathways for trehalose biosynthesis in mycobacteria［J］.Microbiology，2000，146：199-208.

［6］Saito K，Yamazaki H，Ohnishi Y，et al.Production of trehalose synthase from a basidiomycete，Grifola frondosa in Escherichia coli［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1998，50（2）：193-1981.

［7］Chi ZM，Zhe Chi Z，Liu GL，et al.Saccharomycopsis fibuligera and its applications in biotechnology［J］.Biotechnol Adv，2009，27：423-431

［8］張芳.南極低溫酵母Guehomyces pullulans 17-1菌株中海藻糖的合成與調(diào)控［D］.青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2013.

［9］暴增海.食用菌栽培原理與技術(shù)［M］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2000：105-107.

［10］Kong W W，Huang C Y，Chen Q，et al.Nitric oxide is involved in the regulation of trehalose accumulation under heat stress in Pleurotus eryngiivar.tuoliensis［J］.Biotechnology Letters，2012，34（10）：1915-1919.［11］Ferreira A S，Tótola M R，Borges A C.Physiological implications of trehalose in the ectomycorrhizal fungus Pisolithus sp.under thermal stress［J］.Journal of Thermal Biology，2007，32（1）：34-41.

［12］Yutaka Kitamoto，Hajime Akashi1，Hisashi Tanaka1，et al. α-Glucose-1-phosphateformationbyanoveltrehalose phosphorylase from Flammulina velutipes［J］.FEMS Microbiology Letters，1988，55：147-150.

［13］汪虹，陳明杰.草菇冷誘導(dǎo)Cor3基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建［J］.食用菌學(xué)報(bào)，2007，14（3）：16-19.

［14］Bubner B，Baldwin IT.Use of real-time PCR for determining copy number and zygosity in transgenic plants［J］.Plant Cell Rep，2004，23（5）：263-271.

［15］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［16］Zhang F，Wang ZP，Chi Z，et al.The changes in Tps1 activity，trehalosecontentandexpressionofTPS1geneinthe psychrotolerantyeastGuehomycespullulans17-1grownatdifferent temperatures［J］.Extremophiles：life under extreme conditions，2013，17（2）：241-249.

［17］劉秀明.糙皮側(cè)耳和肺形側(cè)耳熱脅迫響應(yīng)的海藻糖代謝調(diào)控研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

Sequence analysis of tps1 and relative expression of tps1 and tps2 under different temperature in Flammulina velutipes

LIU Jian-hui1，2，ZHANG Jun-ling2，LI Liang1，2，SHANG Xiao-dong2，*，TAN Qi1，2，*
（1.College of Food Science&Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization（South），Ministry of Agriculture，P.R.China，National Engineering Research Center of Edible Fungi，Shanghai 201403，China）

The study aimed at discussing trehalose synthesis-related enzyme genes of Flammulina velutipes and their functions，which could lay the foundation for revealing the changing rule during growth and development process.The sequence of tps1 gene was analyzed and relative quantitative expression changes of tps1 and tps2 in mycelia of Flammulina velutipes strain Dan 3 under temperature variations were measured by using real-time PCR.Results showed that open reading frame of tps1 gene contained 1455 bp encoding a polypeptide of 484 amino acid residues.After analysis of the section of 2000 bp upstream of initiator codon，it was found that the promoter contained typical regulatory elements，STRE（C4T）and HSE（AG4）.The real-time PCR analysis showed that the relative expression of tps1 gene and tps2 gene both significantly（p＜0.05）increased after 2 hours management of relatively high temperature 37℃and relatively low temperature 4℃.The results confirmed that the expression of the tps1 and tps2 gene was regulated by temperature at transcriptional level.

Flammulina velutipes；temperature variations；tps1 gene；tps2 gene；real-time PCR；bioinformatics

TS201.3

A

1002-0306（2015）16-0173-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.027

2014-10-13

劉建輝（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食藥用菌遺傳與育種，E-mail：709956413@qq.com。

譚琦（1963-），女，博士，研究員，研究方向：食用菌遺傳育種，E-mail：syj0@saas.sh.cn。尚曉冬（1973-），男，博士，研究員，研究方向：食用真菌栽培育種，食用菌菌種、產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)方法探索研究，E-mail：xdshang@163.com。

國(guó)家科技支撐項(xiàng)目（2013BAD16B02）；上海市科技人才計(jì)劃項(xiàng)目（13XD1424700）。