黑大蒜發(fā)酵過程中功能性成分以及抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化研究

崔春蘭，鄭虎哲，田　躍，張澤林

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003）

黑大蒜發(fā)酵過程中功能性成分以及抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化研究

崔春蘭，鄭虎哲*，田躍，張澤林

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003）

采用五階段發(fā)酵法制備黑大蒜，并研究了發(fā)酵各階段黑大蒜的功能性成分的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，第一階段是還原糖含量、抗氧化物質(zhì)和活性的增強(qiáng)階段，還原糖含量、總多酚含量、總黃酮類含量、DPPH自由基清除能力以及FRAP鐵還原抗氧化力相比新鮮大蒜分別增加了12、4、7、7、7倍；第二階段是大蒜中的蒜氨酸轉(zhuǎn)換為S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜的過程，S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜的含量比新鮮大蒜增加了12倍；第三階段是促進(jìn)大蒜轉(zhuǎn)變?yōu)椤昂凇贝笏獾倪^程；第四階段和第五階段是發(fā)酵完善和后熟階段。

發(fā)酵黑大蒜，功能性成分，抗氧化活性，動(dòng)態(tài)變化

大蒜是百合科蔥屬植物（Allium Sativum L.）的鱗莖，在東南亞的大部分國(guó)家是一種常見的烹飪調(diào)味品及健康產(chǎn)品，它具有抗菌消炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，因此也被稱為“植物藥之最”［1］。但過多生吃大蒜，易動(dòng)火，耗血，影響視力，對(duì)胃腸道也有刺激作用。所以，陰虛火旺，患有胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腎炎、心臟病和便秘者不宜多吃。因此，大蒜新產(chǎn)品及其加工技術(shù)一直是人們關(guān)心和研究的熱點(diǎn)。近年來，發(fā)酵黑大蒜受到學(xué)者和消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。發(fā)酵黑大蒜是用新鮮的生蒜，帶皮放在高溫高濕的發(fā)酵箱里，讓其自然發(fā)酵制成的食品，它在保留生大蒜原有成分的基礎(chǔ)上，使生大蒜的抗氧化、抗酸化功效提高了數(shù)十倍，又把新鮮大蒜本身的蛋白質(zhì)大量轉(zhuǎn)化為人體每天所必需的17種氨基酸進(jìn)而被人體迅速吸收，對(duì)增強(qiáng)人體免疫力、恢復(fù)人體疲勞，保持人體健康起到巨大地積極作用，對(duì)糖尿?。?］、高血壓［2］、高血脂［2］以及癌癥［3］都有非常顯著的防治功效，而且味道酸甜，食后無蒜味，不上火，是速效性的保健食品［1］。

自黑大蒜研發(fā)以來，在日本、韓國(guó)、新加坡等地迅速風(fēng)靡。目前國(guó)內(nèi)也有一些相關(guān)發(fā)明專利技術(shù)［4-5］。但是大部分專利只涉及制作工藝，并沒有揭示出黑大蒜發(fā)酵過程中各種成分的變化規(guī)律，特別是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如還原糖、氨基酸等）、功能性成分（如總多酚、S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜等）以及抗氧化活性。開發(fā)具有保健功效的黑大蒜的核心工藝是發(fā)酵過程中溫度、相對(duì)濕度、時(shí)間等參數(shù)的確定。如發(fā)酵處理稍微不慎，生產(chǎn)出的“黑大蒜”中各種抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化活性不會(huì)顯著增加，因此，進(jìn)一步完善黑大蒜發(fā)酵工藝很有必要。本試驗(yàn)重點(diǎn)研究黑大蒜發(fā)酵過程中還原糖等營(yíng)養(yǎng)成分以及總多酚等抗氧化物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化以及規(guī)律，為進(jìn)一步優(yōu)化黑大蒜發(fā)酵工藝提供技術(shù)和科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑大蒜本試驗(yàn)以2013年江蘇省淮安地區(qū)產(chǎn)新鮮白皮14～16瓣大蒜為原料，采用專利技術(shù)［5］加工成黑大蒜，在大蒜發(fā)酵的各個(gè)階段采集樣品，并保存于-10℃的冷藏庫(kù)內(nèi)，供試驗(yàn)用；乙腈為色譜純；其他試劑均采用優(yōu)級(jí)純以上；蒜氨酸（純度為98%）和S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜（純度為98%）購(gòu)于Sigma公司。

kbf p720型恒溫恒濕培養(yǎng)箱濟(jì)南貝思生物科技有限公司；HH-8型恒溫水浴鍋江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；759S型紫外-可見分光光度計(jì)上海棱光技術(shù)有限公司；Shimadzu LC-6A型高效液相色譜儀日本Shimadzu公司。

1.2發(fā)酵工藝

黑大蒜的發(fā)酵工藝分五階段進(jìn)行，第一階段的發(fā)酵溫度79℃，相對(duì)濕度90%，70 h；第二階段的發(fā)酵溫度50℃，相對(duì)濕度90%，45 h；第三階段的發(fā)酵溫度90℃，相對(duì)濕度90%，20 h；第四階段的發(fā)酵溫度52℃，相對(duì)濕度40%，80 h；第五階段是25℃室溫下放置100 h。

1.3還原糖含量和總氨基酸含量的測(cè)定

還原糖含量的測(cè)定選用DNS比色法［6］，在540 nm下測(cè)吸光值。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。總氨基酸含量采用陳凱等［7］的方法測(cè)定。在568 nm處測(cè)吸光度。

1.4總多酚和總黃酮含量的測(cè)定

總多酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocalteau法，用沒食子酸（Gallic acid）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品總多酚含量以每克樣品達(dá)到同樣吸光度所需的沒食子酸的毫克數(shù)（mg GAE/g）表示［8］?？傸S酮含量測(cè)定參照J(rèn)ia等［9］的方法，以每克樣品達(dá)到同樣吸光度所需的槲皮素（Quercetin）的毫克數(shù)（mg QE/g）表示。

1.5抗氧化活性的測(cè)定

DPPH（1，1-二苯基苦基苯肼）自由基清除能力的測(cè)定采用Lim等［10］的方法，并以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。樣品DPPH活性以達(dá)到同樣吸光度所需的Trolox的毫摩爾數(shù)表示（mmol TE/g）。FRAP（ferric reducing-antioxidant power，鐵還原抗氧化力）的測(cè)定采用Shahrokh等［11］的方法，并以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)RAP活性以達(dá)到同樣吸光度所需的Trolox的毫摩爾數(shù)表示（mmol TE/g）。

1.6蒜氨酸和S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜含量的測(cè)定

稱取5 g大蒜試樣并搗碎，用80 mL蒸餾水洗入100 mL容量瓶中，至80℃水浴中保溫2 h，取出，冷卻，定容，過濾，備用。蒜氨酸和S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜含量的測(cè)定采用高效液相色譜法，色譜柱選用RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Alltech Co，USA）；流動(dòng)相為20 mmol/L磷酸二氫鈉、10 mmol/L庚烷磺酸鈉（A）和乙腈、10 mmol/L庚烷磺酸鈉（B）；流速為0.2 mL/min；檢測(cè)器為紫外光檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量為20 μL。蒜氨酸和S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜對(duì)照品的峰面積-濃度回歸方程分別為y= 44759x-10115和y=92144x-1033.7。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示，ANOVA過程做差異顯著性測(cè)驗(yàn)，并進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析（p＜0.05）。

2　結(jié)果與討論

2.1黑大蒜發(fā)酵階段的確立

發(fā)酵黑大蒜是在高溫、高濕的環(huán)境下長(zhǎng)時(shí)間自然發(fā)酵而成的一種保健食品，即發(fā)酵過程不是利用微生物發(fā)酵，而是在高溫高濕條件下，自身組織遭到破壞后，自身物質(zhì)所發(fā)生的物理化學(xué)反應(yīng)，特別是美拉德反應(yīng)起了關(guān)鍵作用［1］。美拉德反應(yīng)是十分復(fù)雜的化學(xué)過程，反應(yīng)歷程、反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)受氨基酸及糖種類、性質(zhì)的影響，而且還與反應(yīng)時(shí)pH、溫度、相對(duì)濕度、時(shí)間以及金屬離子等有關(guān)［12］。美拉德反應(yīng)通常分為三個(gè)階段，即反應(yīng)的早期階段、中間階段以及末期階段［13］。羅倉(cāng)學(xué)等［1］、Bae等［3］從不同時(shí)間、不同溫度研究黑蒜發(fā)酵工藝。周廣勇等［14］對(duì)黑大蒜貯藏過程中主要成分和抗氧化能力的變化研究表明，貯藏100～120 d后，各項(xiàng)理化指標(biāo)保持相對(duì)穩(wěn)定。本研究中經(jīng)過前期的試驗(yàn)，將美拉德反應(yīng)分為五個(gè)階段，即把中間階段和末期階段各分為兩個(gè)階段，最終確定第一階段的發(fā)酵溫度79℃，相對(duì)濕度90%，70 h；第二階段的發(fā)酵溫度50℃，相對(duì)濕度90%，45 h；第三階段的發(fā)酵溫度90℃，相對(duì)濕度90%，20 h；第四階段的發(fā)酵溫度52℃，相對(duì)濕度40%，80 h；第五階段是25℃室溫下放置100 h。

2.2黑大蒜發(fā)酵過程中還原糖和總氨基酸含量的變化

黑大蒜發(fā)酵過程中還原糖和總氨基酸含量的變化如圖1所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，大蒜中的還原糖含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，特別是在第一階段和第三階段的還原糖含量增加明顯，從發(fā)酵前的0.7 g/100g分別增加到3.5 g/100g和6.8 g/100g。孫寶華等［13］的研究成果表明還原糖是美拉德反應(yīng)的主要物質(zhì)，其單糖的生成速度顯著高于雙糖的生成速度。本研究結(jié)果也證明這一點(diǎn)，在第二階段溫度降低引起還原糖增量的降低，隨著第三階段提高發(fā)酵溫度，還原糖的生成速度明顯提高。在整個(gè)發(fā)酵過程中氨基酸含量也持續(xù)上升，從發(fā)酵前的1.3 g/100g增加到第五階段的7.8 g/100g。這是因?yàn)榻?jīng)長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵和熟成使大蒜中所含的蛋白質(zhì)被分解為氨基酸；碳水化合物被分解為更具營(yíng)養(yǎng)的糖類物質(zhì)。孫寶華等［13］表示發(fā)酵溫度影響氨基酸的生成量，各階段的溫度相差10℃時(shí)氨基酸生成速度相差3～5倍。Sung［15］分四個(gè)階段研究黑大蒜過程中氨基酸含量的變化，得到與本研究相似的結(jié)果。另外，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，新鮮大蒜逐漸變黑，特別是從第三階段開始，大蒜表面由于失水以及美拉德反應(yīng)引起蛋白黑素的逐漸形成［5］。

圖1　黑大蒜發(fā)酵過程中還原糖和總氨基酸含量的變化Fig.1　The changes in the reducing sugar content and total amino acid content of garlic during fermentation

2.3黑大蒜發(fā)酵過程中總多酚和總黃酮含量的變化

黑大蒜發(fā)酵過程中總多酚和總黃酮含量的變化如圖2所示。由圖2可見，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，大蒜中的總多酚和總黃酮含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，特別是在第一階段增加顯著（p＜0.05），從發(fā)酵前的1.51 mg GAE/g和0.58 mg QE/g分別增加到3.33 mg GAE/g和2.04 mg QE/g。發(fā)酵到第五階段時(shí)，總多酚和總黃酮含量分別達(dá)到6.01 mg GAE/g和4.15 mg QE/g，比新鮮大蒜分別高出4倍和7倍。孫月娥等［16］指出大蒜中多酚類物質(zhì)的主要成分為沒食子酸類化合物，在受熱過程中，大分子化合物發(fā)生分解，生成小分子物質(zhì)，釋放出更多含有酚羥基的化合物，因而使多酚類物質(zhì)的含量得到提高。Sung［15］則解釋總多酚和總黃酮含量增加的原因是在高溫、高濕條件下新鮮大蒜中的其他化合物轉(zhuǎn)化的結(jié)果。

圖2　黑大蒜發(fā)酵過程中總多酚和總黃酮含量的變化Fig.2　The changes in the total polyphenol content and flavonoid content of garlic during fermentation

2.4黑大蒜發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化

黑大蒜發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化如圖3所示?？梢钥闯龊诖笏獾目寡趸芰Ρ刃迈r大蒜顯著增強(qiáng)（p＜0.05）。其中，鐵還原抗氧化力變化更顯著。新鮮大蒜的鐵還原抗氧化力和DPPH自由基清除率分別為50.8 mmol TE/g和41.8 mmol TE/g。在發(fā)酵第三階段時(shí)，黑大蒜對(duì)鐵還原抗氧化力和DPPH自由基清除能力趨于穩(wěn)定，分別為287.4 mmol TE/g和223.4 mmol TE/g。發(fā)酵到第五階段時(shí)，自由基清除能力分別達(dá)到351.1 mmol TE/g和289.7 mmol TE/g。孫寶華等［13］提出黑大蒜中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，如氨基酸以及糖的增加是抗氧化能力顯著提高的直接原因，孫月娥等［16］指出隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，多酚類物質(zhì)的增加也是其抗氧化能力增加的原因之一。本研究結(jié)果與Kim等［17］、王玉榮等［18］研究結(jié)果相似，即大蒜在發(fā)酵過程中，DPPH自由基清除能力明顯提高，并且與多酚含量的變化有一定的關(guān)系。

圖3　黑大蒜發(fā)酵過程中FRAP和DPPH的變化Fig.3　The changes in the FRAP and DPPH of garlic during fermentation

2.5黑大蒜發(fā)酵過程中蒜氨酸和S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜的變化

大蒜的主要功效成分之一是含硫有機(jī)化合物，完整大蒜中含有γ-谷氨酰半胱氨酸和半胱氨酸亞砜等兩種硫化物。烯丙基半胱氨酸亞砜大約占半胱氨酸亞砜的80%，當(dāng)完整大蒜細(xì)胞受損時(shí)，蒜酶釋出，催化蒜氨酸產(chǎn)生硫代亞磺酸酯即大蒜辣素。大蒜辣素不穩(wěn)定，進(jìn)一步分解形成S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜等水溶性含硫化合物和烯丙基硫化物等脂溶性含硫化合物［3］。由圖4和圖5可知，新鮮大蒜中的蒜氨酸含量為5.4 mg/g，隨著大蒜的發(fā)酵其含量急劇下降，第五階段時(shí)含量降到1.7 mg/g。與之產(chǎn)生鮮明對(duì)比的是S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜的改變，從新鮮大蒜中的0.5 mg/g增加到6.1 mg/g。這是因?yàn)榻?jīng)長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵和熟成，新鮮大蒜中含有的蒜氨酸物質(zhì)通過發(fā)酵還原為更具抗氧化能力的S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜物質(zhì)。鐘成等［19］報(bào)道，新鮮大蒜在美拉德反應(yīng)過程中，大蒜中不穩(wěn)定蒜氨酸轉(zhuǎn)化成S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜，使黑蒜的體外抗氧化作用高于新鮮大蒜。另外，從圖4可知，作為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，除了S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜，還增加了其他未知樣，如U1、U2等，推斷這些產(chǎn)物對(duì)提高黑大蒜的抗氧化作用也起了一定作用。

圖4　利用高效液相色譜儀檢測(cè)新鮮大蒜（A）和發(fā)酵黑大蒜（B）中蒜氨酸和S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜含量Fig.4　HPLC chromatograms of alliin and S-allyl-L-cysteine in flesh garlic（A）and black garlic（B）

圖5　黑大蒜發(fā)酵過程中蒜氨酸和S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜的變化Fig.5　The changes in the alliin and S-allyl-L-cysteine of garlic during fermentation

3　結(jié)論

本試驗(yàn)分五個(gè)發(fā)酵階段研究黑大蒜發(fā)酵過程中各種營(yíng)養(yǎng)成分及功能性成分的動(dòng)態(tài)變化以及規(guī)律。結(jié)果表明，第一階段是制作發(fā)酵黑大蒜的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是還原糖含量、抗氧化物質(zhì)和活性的增強(qiáng)階段；第二階段是大蒜中含有的硫磺類化合物蒜氨酸轉(zhuǎn)換為S-烯丙基-L半胱氨酸亞砜等硫化物的過程；第三階段是促進(jìn)大蒜轉(zhuǎn)變?yōu)椤昂凇贝笏獾倪^程，也是影響糖、酸含量的階段；第四階段是發(fā)酵完善階段；第五階段作為后熟階段。本研究為進(jìn)一步優(yōu)化黑大蒜發(fā)酵工藝提供技術(shù)和科學(xué)依據(jù)。

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Effect of fermentation stage on functional compounds and antioxidant capacity change of black garlic

CUI Chun-lan，ZHENG Hu-zhe*，TIAN Yue，ZHANG Ze-lin
（Jiangsu Food&Pharmaceutical Science College，Huai’an 223003，China）

In order to product black garlic from fresh garlic，five-stage fermentation techniques had been used and dynamic changes of functional compounds during fermentation stage were measured.The results indicated that the first fermentation stage strongest affect on reducing sugar content and antioxidant activities.Reducing sugar content，total phenolic content，total flavonoid content，DPPH and FRAP activities increased by about 12，4，7，7 and 7 times，respectively，compared with fresh garlic.The second fermentation stage strongest affect on alliin and S-allyl-L-cysteine contents，that S-allyl-L-cysteine content increased by about 12 times，compared with fresh garlic.The third fermentation stage strongest affect on Maillard reaction efficiency.In addition，the fourth and fifth fermentation stage strongest affect on post-fermentation efficiency.

black garlic；functional compounds；antioxidant activity；dynamic change

TS255.1

A

1002-0306（2015）16-0151-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.023

2014－11－20

崔春蘭（1976-），女，碩士，講師，研究方向：功能性食品開發(fā)，E-mail：tigerccl@163.com。

鄭虎哲（1974-），男，博士，副教授，研究方向：功能性食品開發(fā)，E-mail：huzhezheng@163.com。

江蘇省《2014年度高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目》（201413104003Y）；江蘇省青藍(lán)工程資助項(xiàng)目（蘇教師（2014）23號(hào)）。