固相萃取-高效液相色譜法測定畜禽肉中復合硝基酚鈉殘留

林燕翠，曹　　濤，*，唐中令，盧　　芳，王洪軍

（1.深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳618000；2.嘉吉動物蛋白（安徽）有限公司，安徽滁州239000）

固相萃取-高效液相色譜法測定畜禽肉中復合硝基酚鈉殘留

林燕翠1，曹濤1，*，唐中令1，盧芳1，王洪軍2

（1.深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳618000；2.嘉吉動物蛋白（安徽）有限公司，安徽滁州239000）

通過堿性溶液提取，再用正己烷萃取除去脂肪，用乙酸調(diào)pH為酸性條件后用乙酸乙酯-異丙醇反萃取，濃縮后再通過混合陰離子固相萃取柱凈化，最后采用高效液相色譜分離檢測。結(jié)果：三種復合硝基酚鈉組分在0.05～1.0 μg/mL范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈線性，相關(guān)系數(shù)均可達到0.999；通過萃取、反萃取以及固相萃取等多種手段凈化，樣品基質(zhì)幾乎無干擾，檢出限可達到0.003～0.005 mg/kg；通過對0.25、0.5、1.0 μg進行加標測試，其回收率在81%～95%之間，相對標準偏差均小于10%。

固相萃取，高效液相色譜法，復合硝基酚鈉

復合硝基酚鈉也稱為復硝酚鈉，其主要成分包括5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉（5NG）、鄰硝基苯酚鈉（ONP）和對硝基苯酚鈉（PNP），作為一種廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑能夠加速動植物生長［1-3］，提高產(chǎn)量，既可單獨使用，也可以作為增效劑與農(nóng)藥、肥料、飼料等配合使用，在農(nóng)藥以及養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域適用非常廣泛。然而，由于該類物質(zhì)含有高致毒的苯酚基團和硝基苯基團，能夠促使細胞變性、蛋白凝固，對皮膚具有強烈刺激作用，且會在環(huán)境中富集，對人以及環(huán)境的危害非常大［4-6］。我國在2002年已經(jīng)通過農(nóng)業(yè)部第193號公告明確規(guī)定禁止在所有用途和所有食用動物中添加硝基酚鈉，同年在農(nóng)業(yè)部第235號公告中要求所有食用動物中不得檢出該類物質(zhì)。目前對復合硝基酚鈉的檢測標準僅有針對出口蔬菜采用GC-ECD方法檢測［7］以及對復合硝基酚鈉原藥組分以及飼料的檢測文獻［8-11］，而對于不得添加和不得檢出的動物性食品并沒有國家或行業(yè)的標準方法，并且相關(guān)文獻也參考GC-ECD方法對魚蝦類產(chǎn)品進行分析［12］，然而該方法由于前處理復雜，衍生化對試劑和條件要求苛刻，方法靈敏度和精密度存在一定不足。本文以最具有代表性的動物性食品-畜禽肉為基質(zhì)，根據(jù)復硝基酚鈉組分在不同pH溶解性差異用堿溶液提取，正己烷除去脂肪，酸性條件下用乙酸乙酯-異丙醇混合溶劑反萃取。再結(jié)合其結(jié)構(gòu)特性，利用硝基苯酚結(jié)構(gòu)的強吸電子基團與混合陰離子固相萃取柱填料的季銨鹽結(jié)構(gòu)選擇性結(jié)合的特點，選擇用混合陰離子固相萃取柱凈化，再用高效液相色譜-紫外檢測器完成畜禽肉類食品的定量檢測［13］，以期為動物性食品中復合硝基酚鈉殘留的檢測提供檢驗依據(jù)，從而規(guī)范復合硝基酚鈉的使用，為動物性食品安全添磚獻瓦。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

甲醇、正己烷、乙酸乙酯、甲酸、異丙醇均為色譜純均購自JT·Baker；鹽酸為優(yōu)級純購自JT·Baker；氫氧化鈉、氯化鈉、氨水為分析純購自上海國藥集團化學試劑有限公司；純水實驗室自制一級實驗用水。

LC-20A液相色譜儀，配備紫外檢測器日本島津公司；HP5016SY型氮吹儀上海濟成分析儀器有限公司；LJX-ⅡB型離心機上海安亭科學儀器；pH計意大利哈納；Cleanert PAX混合型陽離子固相萃取柱500 mg/6 mL，購自天津博納艾杰爾科技有限公司，使用前依次用3 mL水和3 mL 5%氨水甲醇溶液活化；對硝基苯酚、鄰硝基苯酚、2-甲氧基-5硝基苯酚均為分析標準品均購自阿拉丁試劑公司，純度均大于99.5%。

1.2實驗方法

1.2.1復合硝基酚鈉的提取畜禽肉類樣品去骨后經(jīng)過組織搗碎機制備成肉糜，稱取肉糜樣品2.0 g于50 mL離心管中，加入0.5 mol/L氫氧化鈉水溶液10 mL，振蕩提取10 min后4000 r/min離心3 min，取上清液于另一套50 mL離心管中，加入10 mL正己烷，振蕩后以4000 r/min離心3 min，上層溶液棄去。用3 mol/L的鹽酸調(diào)整pH至3.0，再加入5.0 g氯化鈉，振蕩，加入15 mL乙酸乙酯-異丙醇（4∶6）混合溶劑混勻，振蕩后4000 r/min離心5 min，取上層溶液于15 mL離心管中，50℃下氮吹至約1 mL，待凈化。

1.2.2提取溶液的凈化向樣品提取液中加入3 mL含5%氨水的甲醇溶液，通過已活化好的混合陽離子固相萃取柱，再加入3 mL水溶液淋洗，抽干，用5 mL 2%甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液50℃氮吹至約0.5 mL（不得吹干），用流動相定容至2 mL，0.45 μm濾膜過濾待測。

1.2.3檢出限的測定對濃度各為0.01 μg/mL的三種混合標液重復進樣7次，根據(jù)其峰面積計算7次測定結(jié)果的平均峰面積以及標準偏差，根據(jù)檢出限計算公式，得到儀器檢出限D(zhuǎn)L。本次實驗過程稱量樣品為2.0 g，定容體積為2.0 mL，根據(jù)儀器檢出限換算成方法檢出限MDL。

1.3測定條件

色譜柱：Venusil ASB C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動相為甲醇∶pH=3.0水（55∶45，v/v）；柱溫：30℃；檢測波長：0～10 min波長為320 nm，10 min后波長為275 nm；進樣量：20 μL。

1.4結(jié)果計算

式中，X—試樣中5NP，PNP，ONP的含量，mg/kg；c—樣品溶液代入標準曲線得到的濃度值含量，μg/mL；V—樣品最終定容體積，mL；m—樣品稱樣量，g。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜圖及流動相的選擇

由于待測組分在偏酸性條件下才不會被電離，從而能被C18色譜柱有效保留，所以考慮水相流動相應(yīng)該調(diào)整為弱酸性，實驗固定其他條件，調(diào)整pH從2.0～6.0進行對三種物質(zhì)進行測定，檢測發(fā)現(xiàn)pH在2.0時出峰提前一點，5NP和PNP的峰型略有重疊，分離度略差。而當pH大于5時峰寬增加，推測為pH增加導致溶液H+濃度下降，使組分電離平衡向電離方向便宜，在色譜柱中分配不集中，導致峰寬增加。而pH在3.0～4.0之間時出峰時間和峰型變化不大，但pH=3.0時靈敏度略高一點，因此本實驗用磷酸調(diào)pH=3.0，有機相采用甲醇。

當水相比例35%時，出峰較快，峰型好，但是ONP和PNP的分離度只有1.1，不能有效分離；當水相比例在55%時，5NP和PNP的分離度雖然有所提高，但是ONP的出峰時間延遲到20min后，峰型較差，容易出現(xiàn)拖尾，因此本實驗采用45%的水相作為檢測流動相，分離度都大于1.5，而且峰型尖銳，比較適合定量分析。結(jié)果如圖1所示，其中5NP保留時間為6.99 min；PNP保留時間為7.48 min；ONP保留時間為12.55 min。

圖15　NP、PNP和ONP標準溶液的色譜圖Fig.1　The standard solution chromatogram of 5NP，PNP and ONP

2.2檢測波長選擇

采用二極管陣列檢測器對ONP、PNP以及5NP進行了波長掃描，如圖2所示，5NP最大吸收波長為343 nm，PNP最大吸收波長為317 nm，ONP最大吸收波長為275 nm，由于5NP和PNP出峰時間靠近，無法變波長進行檢測，綜合考慮選擇320 nm作為檢測波長，這樣二者均有較大吸收，而ONP可以選擇最大吸收波長275 nm作為檢測波長。因此本實驗0～10 min采用320 nm，10 min之后275 nm作為檢測波長。

2.3前處理分析

由于復合硝基酚鈉的三種組分在堿性條件下均以負離子形式存在，容易溶解在水相中，因此本實驗采取堿溶液提取，不僅能夠阻止大部分水不溶性的雜質(zhì)，而且強堿性能夠使蛋白質(zhì)變性形成沉淀，通過離心除去，而微溶于水中的脂肪顆粒則可以通過正己烷萃取除掉。通過調(diào)整酸性條件后，三種組分呈現(xiàn)分子形態(tài)，能在有機溶劑中富集；加入氯化鈉飽和水相能進一步降低待測物在水相中殘留，提高提取效率。由于三種組分均具有一定揮發(fā)性，不適合旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；另外，通過標準品驗證，氮吹干后再復溶，目標物損失50%以上，尤其是ONP幾乎損失100%，因此在氮吹時也不能吹干，至少應(yīng)保留0.5 mL溶劑（如圖3、圖4所示）。

圖25　NP、PNP和ONP波長掃描圖Fig.2　The wavelength scan of 5NP，PNP and ONP

圖3　1.0 μg/mL標準溶液氮吹至約0.5 mL復溶Fig.3　1.0 μg/mL standard solution nitrogen to about 0.5 mL dissolution

圖4　1.0 μg/mL標準溶液氮吹干復溶Fig.4　1.0 μg/mL standard solution of nitrogen to dry dissolution

2.4線性范圍及相關(guān)系數(shù)

對濃度范圍0.05～1.0 μg/mL混合標準溶液進行二元線性擬合，根據(jù)表1所示，PNP、ONP和5NP三種組分含量以及峰面積呈線性關(guān)系，其中5NP線性回歸方程Y=45231X+30，R2=0.9999；PNP線性回歸方程Y=90346X-150，R2=0.9999；ONP線性回歸方程Y= 60040X-523，R2=0.9998。

表1　標準曲線記錄表Table 1　The record of standard curve

2.5方法檢出限

本實驗通過對較低濃度（各0.01 μg/mL）的三種混合標液重復進樣7次，其峰面積如表2所示，5NP、PNP以及ONP三種組分檢出限分別為0.005、0.003和0.004 mg/kg。

表2　檢出限峰面積表Table 2　The detection limit of peak area

2.6方法回收率及相對標準偏差

對檢測為陰性的豬肉和雞肉絞碎后分別稱取2.0 g，分別加入0.5、1、2 μg，相同濃度加標重復進行3次實驗，其加標回收率以及相對標準偏差如表3所示，回收率都在81%～95%范圍內(nèi)，相對標準偏差都小于10%。

表3　加標回收率以及相對標準偏差實驗結(jié)果表Table 3　The result of recoveries and relative standard deviation

2.7樣品分析

按照本方法對市售豬肉和雞肉分別抽檢10份，結(jié)果見圖5、圖6，其中一份豬肉檢出ONP，檢出結(jié)果為0.11 mg/kg，其余均為未檢出。

圖5　雞肉樣品色譜圖Fig.5　The Chromatogram of Chicken

3　結(jié)論

本方法通過實驗研究，采用陰離子固相萃取柱凈化，高效液相色譜法測定畜禽肉中復合硝基酚鈉的殘留，提取簡單，回收率均在81%～95%范圍內(nèi)；該方法凈化方式針對性強，雜質(zhì)去除徹底，從而能夠提高靈敏度，5NP、PNP以及ONP三種組分檢出限分別為0.005、0.003、0.004 mg/kg；本方法定量結(jié)果準確，在0.05～1.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999；實驗重復性好，相對標準偏差均小于10%，本文為畜禽肉中復合硝基酚鈉的殘留檢測提供了一定依據(jù)。

圖6　豬肉樣品色譜圖Fig.6　The Chromatogram of Chicken

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Solid phase extraction-determination of nitrophenols sodium residue in meat of livestock and poultry by HPLC

LIN Yan-cui1，CAO Tao1，*，TANG Zhong-ling1，LU Fang1，WANG Hong-jun2
（1.Shenzhen Total Test Technology Co.，Ltd.，Shenzhen 618000，China；2.Cargill Animal Protein（Anhui）Co.，Ltd.，Chuzhou 239000，China）

This method gave an account that extracted by alkaline solution，extracted by hexane to remove the fat，back-extraction with ethyl acetate-isopropanol under acid condition，purified by mixing anionic solid-phase extraction（SPE），finally，using liquid chromatography（HPLC）for testing.The three kinds of compound sodium nitrophenol components concentration and the peak area was linear correlation within the scope of 0.05～1.0 μg/mL.The correlation was 0.999.Through the extraction，back extraction and a variety of means such as solid phase extraction purification，the sample almost had no interference，so the detection limit could reached 0.003～0.005 mg/kg．Through the standard addition test of 0.25，0.5，1.0 μg，its recovery was between 81%～95%，relative standard deviation was less than 10%.

mixing anionic solid-phase extraction（SPE）；HPLC；compound nitrophenols sodium

TS251.7

A

1002-0306（2015）16-0082-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.008

2014－10－31

林燕翠（1988-），女，本科，主要從事畜禽及水產(chǎn)等動物性食品獸藥殘留檢測方面的研究，E-mail：cuill1234@sina.com。

曹濤（1987-），男，本科，主要從事畜禽及水產(chǎn)等動物性食品獸藥殘留檢測方面的研究，E-mail：vitccy@163.com。