UPC2快速測(cè)定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸含量研究

徐　莉，禤開智，紀(jì)少凡，符靈梅，蔣林蓉

（海南省出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，海南?？?70311）

UPC2快速測(cè)定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸含量研究

徐莉，禤開智，紀(jì)少凡，符靈梅，蔣林蓉

（海南省出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，海南?？?70311）

建立了超高效合相色譜法（Ultra Performance Convergence Chromatography，UPC2）分離和測(cè)定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸的方法。超高效合相色譜（UPC2）技術(shù)集合超臨界流體色譜（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）和超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLCTM）的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，流動(dòng)相CO2為主體，0.1%磷酸甲醇為助溶劑。選用Waters BEH色譜柱，流速1.5 mL/min，檢測(cè)波長為245 nm，方法檢出限為2.0 mg/kg，定量限為6.0 mg/kg，線性范圍為2.5～80.0 mg/L；加標(biāo)回收率范圍為93.2%～105.9%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4.5%～9.8%，該方法操作便捷、檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、節(jié)約成本，能夠滿足葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸的檢測(cè)。

超高效合相色譜，葡萄酒，抗壞血酸，異抗壞血酸

抗壞血酸是人體必需的主要維生素之一，能夠保持肌膚潤滑、防止衰老、抗壞血癥等。異抗壞血酸是它的同分異構(gòu)體，其抗氧化能力較強(qiáng)，多作為食品抗氧化劑和肉類的防腐助色劑，但在耐熱性和抗壞血病等活性方面弱于后者。異抗壞血酸不僅在人體代謝過程中可能會(huì)與抗壞血酸發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)作用，從而影響人體對(duì)抗壞血酸的吸收及生理營養(yǎng)作用的發(fā)揮，而且攝入過多也會(huì)導(dǎo)致身體的多種不適，如白細(xì)胞抗病能力下降、尿酸、結(jié)石、皮疹等［1］。

基于上述兩種物質(zhì)的抗氧化特性，在葡萄酒生產(chǎn)過程中，抗壞血酸或異抗壞血酸鹽可與二氧化硫聯(lián)合使用，以控制葡萄酒在貯存期間發(fā)生非酶促氧化反應(yīng)［2］。異抗壞血酸作為葡萄酒的使用添加劑，其使用限量為0.15 g/kg。目前國內(nèi)報(bào)道的檢測(cè)方法如熒光法、比色法和滴定法，均只能測(cè)定兩種物質(zhì)的總量［3-4］；而液相色譜法大部分則為直接提取后采用不同的色譜柱如C18、C8、Hilic等或改變流動(dòng)相檢測(cè)［5-9］，但分離效果不佳且分析時(shí)間長、基質(zhì)干擾大。本文擬探討建立的超高效合相色譜（UPC2）國內(nèi)尚未報(bào)道。該方法與其他方法相比不僅具有有機(jī)溶劑的使用量少，前處理操作簡(jiǎn)便，靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)［10-13］，還能避免由于葡萄酒中天然存在的抗壞血酸干擾造成難以對(duì)食品添加劑異抗壞血酸含量的準(zhǔn)確定量。因此，本實(shí)驗(yàn)通過考察超高效合相色譜分離上述兩種目標(biāo)物的影響因素，為口岸進(jìn)出口葡萄酒質(zhì)量監(jiān)管提供一種準(zhǔn)確、可靠、快速、節(jié)約型測(cè)定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸的分離分析方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料與儀器

甲醇、乙腈、磷酸（色譜純） TEDIA公司；CO2（純度99.997%） 海南嘉騰氣體有限公司；抗壞血酸、異抗壞血酸均購自百靈威公司，純度均≥99.0%。

超高效合相色譜儀配有Waters EmpowerTM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Waters公司；MS3 digital旋渦混合器德國IKA公司；320R冷凍離心機(jī)UNIVERSAL公司；移液槍美國Thermo Electron公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)貯備液：分別準(zhǔn)確稱取0.1g抗壞血酸和異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品，用含0.1%磷酸的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液定容至10mL，搖勻，配制成1.0mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～4℃保存。

1.2.2超高效合相色譜條件色譜柱：Waters BEH 3.0 mm×100 mm 1.7 μm；柱溫35℃；流動(dòng)相A：CO2，B：0.1%磷酸甲醇；等度洗脫條件：CO2+0.1%磷酸甲醇（9+1）；流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；檢測(cè)波長245 nm；動(dòng)態(tài)背壓（ABPR）1800 Psi。

1.2.3高效液相色譜條件色譜柱：Waters Hilic 2.1 mm×100 mm 1.7 μm；柱溫35℃；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液+乙腈（1+9）；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長245 nm。

1.2.4樣品前處理稱取2.5 g葡萄酒試樣（精確至0.001 g），置于50 mL具塞試管中，加入甲醇（含0.1%磷酸）-水（8∶2，V/V）溶液定容至25 mL，均質(zhì)5 min，高速冷凍離心機(jī)于4℃下以12000 r/min離心10 min，取離心后液體1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，直接進(jìn)樣分離分析。

2　結(jié)果與討論

2.1液相色譜法與超高效合相色譜法的比較

基于抗壞血酸和異抗壞血酸具有弱酸性，易溶于水且不穩(wěn)定的特性，測(cè)定目標(biāo)物時(shí)多采取流動(dòng)相比例直接提取的方式，從而避免測(cè)定物質(zhì)氧化降解。為了考察超效合相色譜法在測(cè)定葡萄酒基質(zhì)中的優(yōu)越性，本實(shí)驗(yàn)將文獻(xiàn)報(bào)道的0.1%磷酸水溶液提取高效液相色譜法測(cè)定與UPC2法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，前者用于葡萄酒的檢測(cè)不可行，兩種目標(biāo)物的標(biāo)樣分離度較佳，樣品檢測(cè)時(shí)卻出現(xiàn)基質(zhì)干擾、包峰、拖尾等現(xiàn)象，無法進(jìn)行準(zhǔn)確定量，如圖1所示。這可能是由于葡萄酒基質(zhì)中存在酒精所產(chǎn)生的溶劑效應(yīng)。因此，實(shí)驗(yàn)利用超高效合相色譜超臨界流體的特點(diǎn)建立提取液直接上機(jī)的方法測(cè)定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸?？紤]到UPC2系統(tǒng)對(duì)樣品中含水量要求，本實(shí)驗(yàn)最終采用甲醇和水按8∶2比例直接提取上機(jī)測(cè)定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸的含量。

2.2流速及進(jìn)樣量的選擇

超臨界CO2作為流動(dòng)相兼有氣體的低粘度，液體的高密度，以及介于氣液體之間的擴(kuò)散系數(shù)特征，分離過程可具有較高的線速度，因此流速和進(jìn)樣量的選擇對(duì)待測(cè)物質(zhì)檢測(cè)的影響較大。本實(shí)驗(yàn)采用亞2 μm填料色譜柱，選取流速在1.2～2.0 mL/min以及進(jìn)樣量在1.0～5.0 μL范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化：流速過高，峰形好但長時(shí)間易造成儀器系統(tǒng)超壓；進(jìn)樣量過大，峰形寬且塌陷從而影響兩種目標(biāo)物的分離效果。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)設(shè)定流速為1.5 mL/min、進(jìn)樣量為2.0 μL時(shí)，可保證獲得較佳的分離度效果。245 nm波長下抗壞血酸和異抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖2。

圖1　高效液相色譜法測(cè)定標(biāo)樣與加標(biāo)樣品色譜圖比較Fig.1　The standard of chromatogram compare with spiked by HPLC

圖2　D-異抗壞血酸和L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2　Chromatogram of standard of isoascorbic acid and ascorbic acid

2.3流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化

UPC2所采用的流動(dòng)相是以CO2超臨界流體為主體，配比不同有機(jī)溶劑作為助溶劑來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性及溶解性，并加入少量改性劑，從而有效改變目標(biāo)物的峰形和保留時(shí)間以獲得最佳的分離效果。常用助溶劑一般為甲醇、乙腈、乙酸乙酯，實(shí)驗(yàn)考察以上三種常用有機(jī)溶劑發(fā)現(xiàn)，乙腈和乙酸乙酯作為助溶劑時(shí)兩種目標(biāo)物均無響應(yīng)，而加入磷酸改性劑的甲醇溶解能力最佳。劉倩倩等研究建立含0.05%磷酸改性劑的甲醇與CO2梯度洗脫方式測(cè)定維生素C的方法［14］，但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)梯度洗脫無法很好分離葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸?？紤]到UPC2體系中CO2的比例最好不要低于70%，實(shí)驗(yàn)分別選擇CO2∶甲醇（含0.1%磷酸）比例為80∶20、85∶15和90∶10進(jìn)行等度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著CO2比例增加，峰形變窄，保留時(shí)間后延，抗壞血酸和異抗壞血酸能獲得較好分離度。故實(shí)驗(yàn)最終選擇CO2∶甲醇（含0.01%磷酸）比例為90∶10等度洗脫。

2.4動(dòng)態(tài)背壓（ABPR）的選擇

在超高效合相色譜中，動(dòng)態(tài)背壓是為了確保CO2在整個(gè)操作過程中處于超臨界狀態(tài)，當(dāng)背壓升高時(shí)，超臨界流體密度會(huì)增大，溶劑化能力增強(qiáng)，由此說明它的變化也會(huì)影響物質(zhì)的分離。本實(shí)驗(yàn)以CO2和0.01%磷酸甲醇為流動(dòng)相，考察了背壓在1500～2000Psi范圍內(nèi)對(duì)樣品分離的影響。結(jié)果表明，背壓降低，目標(biāo)物色譜峰的保留時(shí)間減少，響應(yīng)增加，柱壓降低。綜合考慮樣品基質(zhì)、保留時(shí)間及色譜柱壓力三個(gè)因素，當(dāng)背壓為1800Psi時(shí)，抗壞血酸和異抗壞血酸能達(dá)到較好的分離。

2.5方法考察

2.5.1線性范圍和靈敏度在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，將濃度為2.5、5.0、20.0、40.0、80.0 mg/L一系列抗壞血酸和異抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制樣品濃度（橫坐標(biāo)x，mg/L）與峰面積（縱坐標(biāo)y，AU）標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，該方法在2.5～80mg/L范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，兩種待測(cè)物的線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.998，根據(jù)S/N信噪比計(jì)算得出抗壞血酸和異抗壞血酸的檢出限均為2.0mg/kg，定量限均為6.0mg/kg。

2.5.2回收率和精密度采用上述的前處理方法對(duì)陰性紅葡萄酒、起泡白葡萄酒樣品進(jìn)行抗壞血酸和異抗壞血酸的添加回收實(shí)驗(yàn)，添加水平分別為10.0、50.0、150 mg/kg，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明回收率在93.2%～105.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.5%～9.8%。結(jié)果如表1所示，方法的重現(xiàn)性好、精密度理想、準(zhǔn)確性高。

表1　抗壞血酸和異抗壞血酸線性范圍、相關(guān)系數(shù)及加標(biāo)回收Table 1　Linear ranges，correlation coefficients（r），spiked recoveries of ascorbic acid and isoascorbic acid

2.5.3實(shí)際樣品的測(cè)定利用上述實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件，準(zhǔn)確稱取干紅葡萄酒、干白葡萄酒和起泡白葡萄酒樣各2.5 g至50 mL具塞離心管中，加入25 mL甲醇（含0.1%磷酸）-水（8+2），均質(zhì)，超聲提取，離心后取1 mL上清液，過濾膜，按“1.2.2色譜條件”的測(cè)定，見圖3～圖5，分別為抗壞血酸11.3 mg/kg，異抗壞血酸42.1 mg/kg，未檢出，以上結(jié)果表明該方法可用于葡萄酒的測(cè)定，無需進(jìn)行復(fù)雜的前處理，干擾小，可直接進(jìn)樣，直接檢測(cè)。

3　結(jié)論

選用CO2和0.1%磷酸甲醇為流動(dòng)相，等度洗脫，利用PDA檢測(cè)方法同時(shí)測(cè)定葡萄酒中抗壞血酸和異抗壞血酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所建立的超高效合相色譜法可以快速分離上述兩種待測(cè)物，前處理過程簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，線性相關(guān)性好，準(zhǔn)確度高，與普通高效液相色譜法相比避免了由于基質(zhì)特殊性造成分離度差難以定量的缺點(diǎn)，試劑使用量少，環(huán)保、運(yùn)行成本低，對(duì)未來的色譜分析提供新的方向，具有較高的實(shí)用價(jià)值，可用于口岸進(jìn)出口葡萄酒的監(jiān)管和產(chǎn)品質(zhì)量控制。

圖3　干紅葡萄酒樣品色譜圖Fig.3　Sample of dry red wine

圖4　干白葡萄酒樣品色譜圖Fig.4　Sample of dry white wine

圖5　起泡白葡萄酒樣品色譜圖Fig.5　Sample of sparking wine

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Research method of rapid determination of isoascorbic acid and ascorbic acid in wine by Ultra-performance Convergence Chromatography

XU Li，XUAN Kai-zhi，JI Shao-fan，F(xiàn)U Ling-mei，JIANG Lin-rong
（Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center，Haikou 570311，China）

A new method was developed for the determination of isoascorbic acid and ascorbic acid in wine by Ultra Performance Convergence Chromatography（UPC2）.The mobile phase was mixture with supercritical CO2and methanol（added 0.1%H3PO4）at a flow rate of 1.5 mL/min.Using the Waters BEH column，UV detector was set at a wavelength of 245 nm.The limit of detection was 2.0 mg/kg，the calibration linear range was 2.5～80.0 mg/L，its spiked recoveries were 93.2%～105.9%，and the relative standard deviation range from 4.5%to 9.8%.The method with high efficient，rapid，simplicity，high sensitivity and accurate results，it was applicable for determination of isoascorbic acid and ascorbic acid in wine.

Ultra Performance Convergence Chromatography（UPC2）；wine；ascorbic acid；isoascorbic acid

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0075-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.006

2014－11－14

徐莉（1981-），女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品有害物質(zhì)檢測(cè)，E-mail：klppt1026@126.com。

海南省科技興海項(xiàng)目（XH201407）；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（313105）。