用rDNA-ITS方法鑒別內(nèi)蒙古多種野生食用菌

劉曉婷 郭九峰王淑妍 李亞嬌 那 日

（內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

用rDNA-ITS方法鑒別內(nèi)蒙古多種野生食用菌

劉曉婷 郭九峰*王淑妍 李亞嬌 那 日

（內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

采用rDNA-ITS分子標記對內(nèi)蒙古地區(qū)市場11種常見野生食用菌，以2個已知長期人工栽培可食用菌種香菇和雙孢蘑菇為比照進行分子鑒定；通過優(yōu)化DNA提取方法及PCR反應(yīng)條件，用通用引物 ITS1/ITS4擴增出650～800 bp的目的DNA片段，經(jīng) PCR 產(chǎn)物直接測序，然后與DNA 序列數(shù)據(jù)庫中的信息資源進行比對，鑒定出11個樣品分屬于卷邊網(wǎng)褶菌、香杏麗蘑、野蘑菇、馬鞍菌、楊樹口蘑、蒙古口蘑和白鱗蘑菇。利用DNAMAN8軟件，分析13個材料rDNA中ITS區(qū)序列，做同源性矩陣，繪制NJ樹，得出13種常見食用菌親緣關(guān)系的結(jié)論。結(jié)果表明：rDNA-ITS分析方法可以有效地劃分不同種屬的菌種，可以區(qū)分出常見野生食用菌。

野生食用菌；DNA提取方法優(yōu)化；rDNA-ITS分子鑒別；同源性分析；食品安全

1 引言

內(nèi)蒙古地區(qū)野生食用菌資源豐富，野生食用菌在為人們提供豐富食物營養(yǎng)的同時，也為食用菌菌種市場混亂，假種、劣種充斥提供了條件，損害了生產(chǎn)者的利益。而誤食“毒蘑菇”等事件的時有發(fā)生，也極大地影響了食用菌產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。為解決這一問題，食用菌的鑒別成為研究熱點，相關(guān)報道逐年增加[1,2]。野生食用菌大多數(shù)屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycoto），少數(shù)屬于子囊菌門（Ascomycota）[3,4]。本試驗涉及到的13種材料中，作為比照的香菇[5～7]和雙孢蘑菇[8]為長期人工培育的食用菌，其他11種為內(nèi)蒙古地區(qū)采集或購買的，多為人們常常食用但容易發(fā)生混淆引發(fā)食品安全問題的野生菌，有常見于報道的蒙古口蘑[9～11]、楊樹口蘑[12,13]等。

傳統(tǒng)的菌種鑒別以子實體形態(tài)、生長特性以及生理生化反應(yīng)特征為依據(jù)，易受環(huán)境因素和生理狀況的影響，對形態(tài)差異較小的種間及種內(nèi)菌株難以鑒別。DNA分子標記技術(shù)具有形態(tài)學(xué)觀察不可比擬的優(yōu)越性，遺傳物質(zhì)不易受環(huán)境影響，而且在生活史任何階段均可獲得。通過DNA分子標記技術(shù)可以快速、有效地判別野生菌中的“相似蘑菇種”。近年來，DNA分子標記和應(yīng)用分子標記鑒定食用菌菌種的技術(shù)得到了迅速發(fā)展[14～16]，如rDNA-ITS方法、RAPD方法[17,18]、SSR方法[19,20]、AFLP[21～23]方法、SCAR方法[24]、SRAP方法[25,26]等。其中rDNA-ITS方法是目前采用較多的菌種鑒定方法，已有大量關(guān)于蒙古口蘑的鑒定報道，但未見對更多種的食用菌菌種鑒定的報道。

ITS（internal transcribed spacers）內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包含2個不同的非編碼區(qū)域的ITS1和ITS2。在ITS兩側(cè)的18S，5.8S，28S編碼區(qū)具有非常保守的區(qū)域，便于設(shè)計引物[27,28]。由于真核生物核糖體DNA（rDNA）的重復(fù)片段中，ITS區(qū)進化速度較快且片段長度適中，該片段在基因組不同重復(fù)單元間十分一致。通過PCR擴增，克隆測序，最后利用測序結(jié)果來分析物種ITS區(qū)同源性關(guān)系，則可以找到物種種間相關(guān)系統(tǒng)進化關(guān)系。使得ITS成為高等真菌種間及種群系統(tǒng)性研究的重要核基因標記，具有很高的應(yīng)用價值[29～31]。

2 試驗材料與方法

2.1 供試材料

11種野生菌鑒別材料均采自或市購于內(nèi)蒙古地區(qū)，編號為1～11號。其俗名，1～5號分別為油蘑、口蘑、黃蓋子、黃蘑、白蘑；6～8號為黑里子；9～11號分別為地木耳、白蘑、黑蘑。另兩個比照菌株香菇、雙孢蘑菇編號為12、13。

2.2 樣品處理

將供試菌的子實體置于烘干箱內(nèi)，45 ℃烘干24 h。然后分別置于微量植物樣品粉碎機內(nèi)粉碎，分裝于離心管內(nèi)，標號1～13。置于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 DNA提取與優(yōu)化

（1）藥品試劑。TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒，氯仿，乙醇。

（2）儀器設(shè)備。低溫離心機，ABI梯度PCR儀，BIO-RAD電泳儀，超微量分光光度計，恒溫水浴箱等。

（3） DNA提取操作步驟。①取事先處理好的食用菌樣品約30 mg。②迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700 μL，65 ℃預(yù)熱緩沖液GP1的離心管中，經(jīng)迅速顛倒混勻后，將離心管65 ℃水浴20 min，水浴過程中顛倒離心管數(shù)次，以混合樣品。③加入700 μL氯仿，充分混勻，12 000 rpm離心5 min。④小心地將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加入700 μL緩沖液GP2，充分混勻。⑤將混勻的液體取700 μL轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12 000 rpm離心30 s，棄掉廢液。⑥向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD（使用前已加入無水乙醇），12 000 rpm離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前已加入無水乙醇），12 000 rpm離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑧重復(fù)操作步驟⑦。⑨將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 rpm離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫下放置2～5 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。⑩將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30～50 μL純水，室溫放置2～5 min，12 000 rpm離心2 min。?將收集到離心管中的溶液重新滴加到吸附膜上，12 000 rpm離心2 min再次洗脫，將溶液收集到離心管中。?用微量分光光度計檢測提取的DNA溶液，并記錄。測量完畢后，置于4 ℃冰箱中短期保存。

2.4 ITS PCR體系建立

采用ITS通用引物ITS1和ITS4，堿基序列（5’-3’）：ITS1，TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4，TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應(yīng)體系為20 μL反應(yīng)體系：Mix 10 μL，引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH20 6 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min，4 ℃保存。電泳條件為：1.5%瓊脂糖凝膠，電壓100 V。

2.5 測序

將上步所得的1～13號DNA樣品PCR擴增產(chǎn)物直接送有關(guān)公司測序，測序引物為PCR引物。

2.6 序列比對

（1）測序結(jié)果分析。NCBI在線BLAST，在GENBANK上分別輸入13條測序結(jié)果進行BLASTn，在基因庫中尋找與本次測序序列相似度高的序列，確定所鑒別的食用菌名稱和相關(guān)菌種信息。根據(jù)測序圖像與網(wǎng)上比對人工校對序列。

（2）運用DNAMAN軟件序列分析。將校對好的13條DNA序列載入DNMMAN8軟件，進行相關(guān)生物信息學(xué)分析。

2.7 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN8軟件，比較載入的13個菌種rDNA-ITS序列，列出同源性矩陣，繪制同源樹，讀圖，找到13個菌種之間的同源關(guān)系。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取優(yōu)化

優(yōu)化的DNA提取方法是將TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒提取植物基因組DNA的方法改進為：提取過程中省略說明書中加巰基乙醇的步驟，洗脫過程中用50 μL純水代替說明書中50 μL洗脫緩沖液TE洗脫兩次。

試驗發(fā)現(xiàn)，對于干燥的真菌組織，是否加巰基乙醇對最后得到DNA的含量和質(zhì)量沒有明顯影響，所以省略了此步。除此之外，對于洗脫過程，用洗脫緩沖液TE洗脫的效果明顯不如純水。改用純水后，DNA含量明顯增高，A260/A280值也回歸在正常的1.7～1.9之間。

用微量分光光度計檢測DNA提取結(jié)果可見，所提取的1～13號食用菌DNA含量均值在18.7～121 ng/μL，含量相對較高；A260/A280值均在1.7～1.9，屬正常范圍（表1）。

表1 DNA含量測定結(jié)果

3.2 ITS擴增結(jié)果

用通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增以后，將1～13號菌種樣品擴增產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠中，電泳35 min，紫外光下檢測并拍照。13個常見食用菌菌種rDNA-ITS擴增產(chǎn)物為650～800 bp長度條帶。7號、8號、11號條帶長度比較一致，5號、10號條帶長度比較一致，2號、4號條帶長度比較一致，剩余的1號、3號、6號、9號、12號、13號也擁有各自長度的條帶（圖1）。可見，用rDNA-ITS方法可以有效地鑒別這13種常見食用菌。

2.3 鑒定結(jié)果

通過對13個菌種rDNA-ITS擴增產(chǎn)物測序，將序列數(shù)據(jù)進行網(wǎng)上BLAST，成功分辨出13份材料。1～13號菌種分別是：卷邊網(wǎng)褶菌、楊樹口蘑、香杏麗蘑、楊樹口蘑、蒙古口蘑、野蘑菇、白鱗蘑菇、白鱗蘑菇、馬鞍菌、蒙古口蘑、白鱗蘑菇、香菇、雙孢蘑菇[32]（表2）。

圖1 供測菌種ITS序列PCR結(jié)果

3.4 同源樹的建立及結(jié)果分析

通過對13個菌種rDNA-ITS擴增產(chǎn)物測序，用DNAMAN8軟件對13條測序結(jié)果進行同源性分析，得到同源性矩陣，并做出NJ樹（圖2）。

不同的菌種間相似性的百分數(shù)有所不同。7號、8號、11號3種白鱗蘑菇，5號、10號2種蒙古口蘑，2號、4號2種楊樹口蘑的相似性百分數(shù)在88.4%～100.0%，表現(xiàn)出較大的相似性。其他幾種食用菌，1號卷邊網(wǎng)褶菌，3號香杏麗蘑，6號野蘑菇，9號馬鞍菌，12號香菇，13號雙孢蘑菇兩兩之間的相似性百分數(shù)雖較低，但也在51.0%以上?？梢?3種常見食用菌，采用該方法可以有效地加以區(qū)分。

從NJ樹中可見，屬于子囊菌門的9號，最早與其他屬于擔(dān)子菌門的12個菌種得以明顯分開；屬于網(wǎng)褶菌科的1號，屬于光茸菌科的12號，先后與其他屬于口蘑科和蘑菇科的菌種也能分開；其中，口蘑屬2號、4號和5號、10號聚為一支，再與麗蘑屬3號聚在一起成為一簇，共屬于口蘑科；蘑菇屬8號、11號、13號與6號聚為一支，再與7號聚在一起成為一簇，共屬于蘑菇科?？傮w來說，NJ樹可以清晰辨別不同種屬食用菌親緣關(guān)系的遠近，為這幾種常見食用菌提供快速、有效的鑒別方法。

圖2 NJ樹

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié) 論

從以上結(jié)果，可得出以下結(jié)論。

（1）TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒的操作步驟經(jīng)過適當(dāng)改進，可以用于高質(zhì)量地提取市售蘑菇子實體DNA。

（2）通過rDNA-ITS序列分析，成功鑒別內(nèi)蒙古地區(qū)13種不同科屬常見食用菌，從而初步確立了快速、有效的鑒定技術(shù)。

（3）通過使用DNAMAN8軟件對13條測序結(jié)果進行同源性分析，得到同源性矩陣，做出NJ樹，明確了各種食用菌的親緣關(guān)系。

（4）通過rDNA-ITS分子標記技術(shù)，可以快速、有效地辨別外形相似的幾種野生菌，食用菌，特別是蘑菇市場銷售產(chǎn)品的真假混亂等問題可以得到有效解決。

4.2 討 論

（1）DNA提取方法優(yōu)化。在改進TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒提取植物基因組DNA的方法試驗中發(fā)現(xiàn)，30 mg食用菌風(fēng)干樣足夠用以提取DNA，提取過程中可以省略加巰基乙醇的步驟，通過在洗脫過程中將50 μL洗脫緩沖液TE改用50 μL純水代替，并洗脫兩次，可以獲得高含量、高質(zhì)量的DNA。

操作過程中，需要注意的是：水浴過程中顛倒離心管以混合樣品的動作要溫和，顛倒次數(shù)越多混合越充分，DNA提取量也越高；在加入氯仿混勻取上層水相的步驟中，從離心機中拿取離心管要小心謹慎，這個步驟將直接影響提取的DNA溶液質(zhì)量；在純水洗脫的步驟中，要將50 μL純水加到吸附柱底面的中部，避免純水粘壁，且不能與DNA接觸，影響洗脫效果，須靜置2～5 min，使純水充分溶解DNA，將其洗脫下來。

所提取的1～13號食用菌DNA含量均值在18.7～121 ng/μL，其中1號卷邊網(wǎng)褶菌，11號白鱗蘑菇提取的DNA含量相對較低，9號馬鞍菌較高，這可能與不同種蘑菇的內(nèi)部性質(zhì)有關(guān)?？傮w來說，通過改進DNA提取方法，整體水平上DNA含量、質(zhì)量明顯提高，達到預(yù)期的效果。

（2）rDNA-ITS分子鑒別。本試驗通過測定常見野生食用菌菌株的rDNA中ITS區(qū)序列來探討各個菌種的同源序列，通過rDNA-ITS序列分析，成功鑒別了內(nèi)蒙古地區(qū)13種常見食用菌菌種，初步確立了快速、有效的菌種鑒定技術(shù)，初步探明rDNA-ITS方法是一種快速、有效、準確的鑒別常見食用菌的分子鑒定方法，也為今后食用菌的鑒別等相關(guān)研究提供一定參考。

表2 野生菌鑒定結(jié)果

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Identification of several edible mushrooms in Inner Mongolia by rDNA-ITS

Liu Xiaoting Guo Jiufeng* Wang Shuyan Li Yajiao Na Ri
(College of Physical Science and Technology, Inner Mongolia University, Huhhot 010021)

In this study, 11 common edible wild mushrooms from Inner Mongolia market were identified by rDNA-ITS molecular markers, and two known strains, Lentinula edodes (Berk.) Pegler and Agaricus bisporus (J.E.Lange) Imbach were used as a reference. 650～800 bp DNA fragments can be amplified by optimizing the DNA extraction method and PCR reaction system, using universal primers ITS1 / ITS4, The sequencing and blasting result showed that 11 mushrooms belong to Paxillus involutus (Batsch) Fr.,Calocybe gambosa (Fr.) Singer., Helvella elastica Bull., Agaricus arvensis Schaeff., Tricholoma populinum J.E. Lange, Tricholoma mongolicum S. Imai, and Agaricus bernardii Quél, respectively.

wild edible mushrooms; DNA extraction method optimization; rDNA-ITS molecular identification; homology analysis; food safety

S646

A

2095-0934（2015）05-301-06

國家自然科學(xué)基金（51267014）

劉曉婷（1991—），女，碩士研究生，研究方向為環(huán)境生物物理。E-mail：liuxiaoting0522@sina.com

郭九峰（1964—），男，研究員，博士，主要從事環(huán)境生物物理研究工作。E-mail：guojf101@sina.com