靈芝化學(xué)成分與質(zhì)量控制方法的研究綜述

陳若蕓

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

靈芝化學(xué)成分與質(zhì)量控制方法的研究綜述

陳若蕓

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

綜述靈芝活性成分和質(zhì)量控制方法的研究進(jìn)展。靈芝化學(xué)成分有三萜類化合物，核苷類化合物，呋喃類衍生物，甾醇類化合物，生物堿類化合物，氫醌及其他類化合物，腦苷及多肽、氨基酸類化合物，多糖、糖肽類化合物，以及有機(jī)酸、長(zhǎng)鏈烷烴類化合物。其已有的質(zhì)量控制方法研究包括比色方法測(cè)定靈芝總?cè)扑岷浚琀PLC方法測(cè)定靈芝三萜酸，靈芝HPLC指紋圖譜研究，高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定核苷類化學(xué)成分的含量，靈芝中甾醇類化合物分析，靈芝孢子油中脂肪酸含量測(cè)定等。

靈芝；三萜化合物；甾醇；質(zhì)量控制；指紋圖譜

【編者按】“第一屆中國(guó)靈芝大會(huì)專欄”是為配合由中國(guó)食品土畜進(jìn)出口商會(huì)、浙江省龍泉市人民政府、浙江省中藥材產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)、浙江省食用菌協(xié)會(huì)于2015年8月在浙江龍泉聯(lián)合主辦的第一屆中國(guó)靈芝大會(huì)活動(dòng)所設(shè)，經(jīng)組委會(huì)同意，刊出國(guó)內(nèi)外學(xué)者多篇相關(guān)文稿。

靈芝屬（Ganoderma）真菌隸屬于多孔菌科（Polyporaceae）藥食兼用菌，全世界共有108種。在我國(guó)有76種，包括靈芝亞屬（55種）、樹(shù)舌靈芝亞屬（20種）和粗皮靈芝亞屬（1種）三個(gè)亞屬，其中靈芝亞屬又可分為靈芝組（29種）和紫芝組（26種）。

到目前為止國(guó)內(nèi)外進(jìn)行過(guò)藥理和化學(xué)研究的靈芝屬真菌有以下20余種：赤芝（Ganodermalucidium）； 紫芝（G. japonium）；薄蓋靈芝（G. capense）；南方靈芝（G. australe）；松杉靈芝（G. tsugae）；樹(shù)舌（G. applanatum）；熱帶靈芝（G. tropicus）；長(zhǎng)孢靈芝（G. boniense）；硬孔靈芝（G. duropora）；無(wú)柄靈芝（G. resinaceum）；茶病靈芝（G. theaecolum）；反柄靈芝（G. cochlear）；黑靈芝（G. atrum）；臺(tái)灣靈芝（G. fomosanum）；狹長(zhǎng)孢靈芝（G. boninense）；G. colossum；G. concinna；G. amboinense；G. pefeifferi；G. orbiforme等[1]。

1 靈芝化學(xué)成分研究

靈芝中共有9類近300余種化合物?；瘜W(xué)工作研究最多的是赤芝，目前已報(bào)道的從中分析到的化學(xué)成分有200余種。

1.1 三萜類化合物

從靈芝中分離到四環(huán)三萜類220 余種，從靈芝四環(huán)三萜化合物的結(jié)構(gòu)來(lái)看，為高度氧化的羊毛甾烷衍生物。按分子所含碳原子數(shù)可分為C30，C27，C24三大類。從赤芝孢子粉中分離到8種三萜類化合物，分別為赤芝孢子內(nèi)酯A，赤芝孢子內(nèi)酯B，赤芝孢子酸A，靈芝酸B、C、E、M，靈芝酮三醇。三萜類化合物是靈芝的主要化學(xué)成分之一，很多三萜類化合物具有生理活性。赤芝孢子酸A（Ganosporeric acid A）對(duì)CCL4和半乳糖胺及丙酸桿菌造成的小鼠轉(zhuǎn)氨酶升高均有降低作用。赤芝孢子內(nèi)酯A（Ganosporelactone A）具有降膽固醇作用。靈芝提取的三萜類化合物能降低CCL4肝損傷小鼠血清GOT、GPT，具保肝作用[2]。

1.2 核苷類化合物

核苷類是具有廣泛生理活性的一類水溶性成分，從薄蓋靈芝菌絲體中分離到5種核苷類化合物，分別為尿嘧啶（Uracil）、尿嘧啶核苷（Uridine）、腺嘌呤（Adenine）、腺嘌呤核苷（Adenosine）和靈芝嘌呤（Ganoderpurine）[3]。

1.3 呋喃類衍生物

靈芝中的呋喃類衍生物是從發(fā)酵的薄蓋靈芝菌絲體乙醇提取物中分離得到的，分別為5-羥甲基呋喃甲醛（5-Hydroxymethylfurfuraldehyde），5-乙酰氧甲基呋喃甲醛（5-Acetoxymethylfurfuraldehyde），5-丁氧甲基呋喃甲醛（5-Butoxymethylfurfuraldehyde），1,1'-二a-糠醛基二甲醚（1,1'-di-a-fur-aldehydicdimethyl ether）[4]。

1.4 甾醇類化合物

靈芝中的甾醇含量較高，僅麥角甾醇含量就達(dá)3‰左右。已知從靈芝中分到的甾醇有近20種，其骨架分為麥角甾醇類和膽甾醇類兩種類型。分別是：麥角甾醇（Ergosterol），麥角甾醇棕櫚酸酯（Ergostapalmitate），5α-豆甾烷二酮3,6（5α-Stigmastan 3,6-dione），β-谷甾醇（β-sitosterol），麥角甾7,22-二烯酮-3（Ergosta-7,22-dien-3-one），麥角甾7,22-二烯-3β-醇（Ergosta-7,22-dien-3β-ol），麥角甾7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇（Ergosta-7,22-dien-3β,5α,6β-triol），麥角甾7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇（Ergosta-7,22-dien-3β,5α,6α-triol），麥角甾7,9,22-三烯-3β,5α,6α-三醇（Ergosta-7,9,22-trien-3β,5α,6α-triol），麥角甾4,6,8(14), 22-四烯酮-3（Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one），羊毛甾7,9(11),24-三烯-3β，21-二醇（lanosta-7,9(11),24-trien-3β，21-diol），24(S)-24-甲基膽甾-7-烯-3β-醇[(24S)24-methyl-5α-cholest-7-en-3β-ol]，24(S)-24-甲基膽甾-7,16-二烯-3β-醇[(24S)24-methyl-5α-cholest-7,16-dien-3β-ol]，異麥角甾醇（iso-ergosterol），麥角甾醇過(guò)氧化物（ergosterol peroxide），麥角甾-7,22-二烯3β-亞油酸酯（Ergosta-7,22-dien-3β-yl-linoleate），麥角甾-7,22-二烯2β,3α,9α-三醇（Ergosta-7,22-dien-2β,3α，9α-triol），環(huán)二氧麥角甾-7,22-二烯-3β-亞油酸酯（epidioxyergosta- 6,22-dien-3β-yl linoleate），麥角甾7,22-二烯-2β,3α,9α-三醇，從紫芝中得到一個(gè)新的甾醇，麥角甾-7,22-二烯-2β，4α-二醇等[5]。

1.5 生物堿類化合物

靈芝中的生物堿含量較低，從發(fā)酵的薄蓋靈芝菌絲體和赤芝孢子粉中分離得到的生物堿有膽堿（Choline），甜菜堿（Betaine）及其鹽酸鹽，靈芝堿甲（Ganoine），靈芝堿乙（Ganodine）和菸酸（Nicotinic acid）[3]。Liuchao[6], Jie-Qing Liu[7]等，從紫芝中得到sinensine，sinensine B，sinensine C，sinensine D，sinensine E等5個(gè)新的生物堿。

靈芝中的生物堿雖然含量較低，但有些具一定的生物活性。如：γ-三甲胺基丁酸在窒息性缺氧模型中有延長(zhǎng)存活期的作用，能使離體豚鼠的心臟冠流增加。臨床上將甜菜堿和N-脒基甘氨酸共用治療肌無(wú)力。

1.6 氫醌類化合物

德國(guó)學(xué)者Ramzi A. A.Mothana[8]從靈芝屬真菌 Ganodema pfeifferi 得到兩個(gè)法呢基氫醌類化合物，分別為ganomycin A和ganomycin B。這兩個(gè)化合物對(duì)格蘭氏陽(yáng)性菌和格蘭氏陰性菌均有抑制作用。

1.7 腦苷及多肽、氨基酸類化合物

日本學(xué)者Yoshiyuki Mizushina等[9]從赤芝子實(shí)體中得到對(duì)DNA聚合酶復(fù)制有抑制活性的腦苷類化合物(4E,8E)-N-D-2’-hydroxypalmitoyl-1-O-β-D-glucopyranosyl-9-methyl-4,8-sphingadienine和(4E,8E)-N-D-2’-hydroxystearoyl-1-O-β-D-glucopyranosyl- 9-methyl- 4,8-sphingadienine。

靈芝不同種之間的氨基酸種類相似，只是含量各不相同，并發(fā)現(xiàn)赤芝孢子粉中含有硫氨基酸。試驗(yàn)證明，天門冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸等，可以提高小鼠窒息性缺氧存活時(shí)間。我們從赤芝孢子粉中分離得到硫組氨酸甲基內(nèi)銨鹽。另有學(xué)者從靈芝中分離到多肽類化合物，包括中性多肽、酸性多肽、堿性多肽，其中一種中性多肽可以提高小鼠窒息性缺氧存活時(shí)間。

1.8 多糖、糖肽類化合物

從靈芝中分離得到近20種多糖和糖肽類化合物，并證明靈芝多糖是抗衰老、扶正固本的有效成分之一。

1.9 有機(jī)酸、長(zhǎng)鏈烷烴類化合物

從靈芝中還得到大量的脂肪酸類等其他化合物，包括硬脂酸、棕櫚酸、花生酸、二十二烷酸、二十三烷酸、二十四烷酸，以及甘露糖和海藻糖等。

2 質(zhì)量控制方法研究

2.1 比色方法測(cè)定靈芝總?cè)扑?/p>

李保明等建立了測(cè)定靈芝總?cè)扑岷康谋壬椒╗10]。靈芝子實(shí)體、靈芝孢子粉用無(wú)水乙醇回流提取，提取液經(jīng)過(guò)堿化、酸化后，用氯仿萃取，萃取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓蒸干，制成無(wú)水乙醇溶液，與硫酸加熱產(chǎn)生顏色反應(yīng)，測(cè)定其吸光度值。對(duì)照品和樣品溶液在526 nm處有最大吸收值，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為526 nm。此法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，樣品背景干擾小，適用于靈芝子實(shí)

體和靈芝孢子粉中總?cè)扑岬暮繙y(cè)定。

表1 靈芝樣品中的總?cè)扑岷浚╪=2）

對(duì)照品溶液的制備。精密稱取靈芝酸B對(duì)照品約5 mg，置于5 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，即得含靈芝酸B約1 mg/mL的對(duì)照品溶液。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 HPLC方法測(cè)定靈芝三萜酸

馬林等建立了測(cè)定靈芝4種三萜酸的HPLC方法[11]。李保明等[12]建立了9種靈芝三萜酸HPLC含量測(cè)定方法，并測(cè)定了31種在不同產(chǎn)地、用不同培養(yǎng)基栽培的赤芝子實(shí)體中的9種三萜酸含量。此方法快速，重現(xiàn)性好，可作為評(píng)價(jià)靈芝質(zhì)量的方法。

9種靈芝三萜酸對(duì)照品均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)室研制提供，經(jīng)IR、UV、NMR、MS等光譜鑒定，其HPLC分析純度在98%以上；赤芝（G. lucidum）藥材的來(lái)源及測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 31種靈芝樣品中三萜含量的測(cè)定結(jié)果

圖1 靈芝指紋圖譜

表3 靈芝樣品來(lái)源

2.3 靈芝HPLC指紋圖譜研究

李保明等[13]采用高效液相色譜法對(duì)靈芝的指紋圖譜進(jìn)行了研究，利用Agilent 1200系統(tǒng)高效液相色譜儀（美國(guó)）、紫外檢測(cè)器（DAD）檢測(cè)，色譜柱為Alltech C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.04%甲酸梯度洗脫，0～10 min時(shí)，乙腈0%～20%，10～20 min時(shí)，乙腈20%～25%，20～50 min時(shí)，乙腈25%～30%，50～65 min時(shí)，乙腈30%～38%；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫15 ℃。15個(gè)靈芝三萜對(duì)照品均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實(shí)驗(yàn)室研制提供，經(jīng)IR、UV、NMR、MS等光譜鑒定，HPLC分析純度為98%以上；分析了18個(gè)批次的靈芝子實(shí)體（樣品來(lái)源見(jiàn)表3），并建立了指紋圖譜，確定了19個(gè)共有峰，包括靈芝酸I（1）、靈芝酸C2（2）、赤芝酸 LM1（4）、靈芝酸G（5）、靈芝烯酸B（6）、靈芝酸B（7）、靈芝烯酸A（9）、靈芝酸A（11）、12-乙酰基-3-羥基-7,11,15,23-四羰基-羊毛甾-8-烯-26-酸（12）、靈芝酸D（13）、赤芝酸A（14）、靈芝烯酸D（15）、靈芝酸C（16）、靈芝酸E（17）、靈芝孢子酸A（19）等15個(gè)已知化合物峰，以及4個(gè)未知化合物峰，其中有13批靈芝樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度均在0.9以上。本試驗(yàn)分別測(cè)定了赤芝（G. lucidum，包括野生和人工栽培）、松杉靈芝（G. tsugae）、鹿角靈芝（G. amboinense）、紫芝（G. sinense）、硬孔靈芝（G. duropora）等樣品，結(jié)果顯示，紫芝和硬孔靈芝在本實(shí)驗(yàn)條件下，沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)；赤芝（栽培）的指紋圖譜相似度大于0.92，兩個(gè)（野生）赤芝分別為0.773和0.909；兩個(gè)鹿角靈芝分別為0.840和0.942；而松杉靈芝則為0.86。從赤芝的指紋圖譜和相似度結(jié)果看出，它們的共有峰均為19個(gè)，相似度雖有差異，但所含成分基本一致（圖1）。在靈芝分類學(xué)上，赤芝和松杉靈芝同為靈芝屬靈芝組真菌，而紫芝和硬孔靈芝則屬于紫芝組，從三萜化合物存在的情況看，兩者也有明顯的區(qū)別，可為靈芝的化學(xué)分類提供參考。

本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為靈芝的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了有效的方法。

2.4 高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定核苷類化學(xué)成分

戴敬、魯靜[14]等建立了高效毛細(xì)管電泳測(cè)定靈芝培養(yǎng)液中核苷類化學(xué)成分的方法，測(cè)定了其中兩種核苷-腺苷和鳥(niǎo)苷的含量。方法為：使用熔融石英毛細(xì)管柱，75 m id X57 cm（有效長(zhǎng)度50 cm），緩沖體系20 mmol/L硼砂含30 mmol/L十二烷基硫酸鈉，添加 5%乙醇（95%），pH 10.0 （1 mmol/L NAOH調(diào)節(jié)）；氣動(dòng)進(jìn)樣時(shí)間15 s；分離電壓10 kV（恒壓方式）；柱溫20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。回歸方程，腺苷：Y=0.0705+0.01707X（r=0.9995）；鳥(niǎo)苷：Y=0.0232+0.01864X（r=0.9999）。平均回收率（n=5）：腺苷為99.22%，RSD=3.66%；鳥(niǎo)苷為104.3%，RSD=1.91%。內(nèi)標(biāo)為：磺胺甲唑。樣品的前處理使用AB-8大孔樹(shù)脂吸附，30%乙醇洗脫。根據(jù)建立的方法，測(cè)定了9批靈芝培養(yǎng)液樣品中腺苷和鳥(niǎo)苷的含量，結(jié)果腺苷的含量在19.3～23.6 g/mL之間，鳥(niǎo)苷的含量在12.5～19.8 g/mL之間。

2.5 靈芝中甾醇類化合物分析

王江[15]等用氣相色譜測(cè)定了鹿角狀靈芝和片狀靈芝的甾醇含量。靈芝中的甾醇用氯仿提取后，加吡啶和醋酐進(jìn)行?；幚?，進(jìn)樣分析，以保留時(shí)間定性，以峰高定量。儀器為日本島津GC-9A型氣相色譜儀、FID檢測(cè)器、C-RSA型數(shù)據(jù)處理機(jī)。色譜條件：玻璃柱2 mX 3 mm，填料2.0% SE-30+1.5% QF-1/chromosorbWAW（60～80目）單體。柱溫245 ℃，檢測(cè)器溫300 ℃，氣化室溫300 ℃，載氣N240 mL/min，H20.10 MPa，Air 0.07 MPa。以菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇為標(biāo)準(zhǔn)品繪制工作曲線，其中鹿角狀靈芝甾醇總量為0.79 mg/g；片狀靈芝的甾醇總量為1.04 mg/g。

2.6 靈芝孢子油中脂肪酸含量測(cè)定

陳體強(qiáng)等[16]采用氣相色譜與質(zhì)譜（GC－MS）進(jìn)行聯(lián)用分析，從超臨界CO2萃取孢子油中鑒定出18種脂肪酸成分，包括6種不飽和脂肪酸、7種飽和脂肪酸、2種環(huán)鏈脂肪酸，以及己酸、辛酸、壬酸等短鏈脂肪酸。GC定量分析結(jié)果表明：靈芝孢子油中檢出9種已知脂肪酸，不飽和脂肪酸總量為73.6% ；其中，主體成分油酸（C18：1）、亞油酸（C18：2）和棕櫚酸（C16：0）等含量分別為57.5%、13.4%、19.6%；此外，不飽和脂肪酸十六碳烯酸（C16：1）和亞麻酸（C18：3）等的含量分別為2.2%和0.5%。

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Review of research on chemical constituents of Ganoderma lucidum and its quality control method

Chen Ruoyun
(State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & PekingUnion Medical College, Beijing 100050, China)

In this paper, researchs of the Ganoderma lucidum active ingredients and quality control methodsare reviewed. The chemical composition of Ganoderma lucidum including triterpenoids, nucleoside compounds, furan derivatives, sterols, alkaloids, hydroquinone, cerebrosides, polypeptides, amino acids compound, polysaccharides, glycopeptides compound, organic acids, long-chain alkanes and other compounds. Its quality control method of the existing research, including colorimetric method of determining total triterpene ganoderma lucidum acid, HPLC method for determination of triterpenoid acid, ganoderma lucidum HPLC fingerprint study, high performance capillary electrophoresis method for determining the content of nucleoside class chemical composition, analyzing sterol compounds in ganoderma lucidum, ganoderma lucidum spore oil fatty acid content determination, etc.

Ganoderma lucidum ; terpene compound; sterol; quality control; fingerprint

S567.3+1

A

2095-0934（2015）05-270-06