薄膜-探頭式超聲法和注乙醇-DHPM法制備的魚(yú)油脂質(zhì)體的理化性質(zhì)研究

涂宗財(cái)，馬　　達(dá)，王　　輝，張　　露，沙小梅

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.江西師范大學(xué)功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330022）

薄膜-探頭式超聲法和注乙醇-DHPM法制備的魚(yú)油脂質(zhì)體的理化性質(zhì)研究

涂宗財(cái)1，2，馬達(dá)1，王輝1，張露1，沙小梅1

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.江西師范大學(xué)功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330022）

通過(guò)比較優(yōu)化后的薄膜-探頭式超聲法（脂質(zhì)體Ⅰ）和注乙醇-DHPM法（脂質(zhì)體Ⅱ）制備的魚(yú)油脂質(zhì)體的理化性質(zhì)及穩(wěn)定性，初步評(píng)價(jià)兩種方法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)。分別測(cè)定脂質(zhì)體Ⅰ和脂質(zhì)體Ⅱ的包封率、載量、粒徑分布、Zeta電位以及形態(tài)觀察和4、25℃條件下貯藏pH變化、貯藏粒徑變化。結(jié)果顯示脂質(zhì)體Ⅱ相比脂質(zhì)體Ⅰ的平均粒徑、多分散指數(shù)（PDI）、Zeta電位小，TEM、AFM顯示脂質(zhì)體Ⅱ比脂質(zhì)體Ⅰ的顆粒完整性更好。4℃和25℃條件下分別貯存35d的對(duì)比結(jié)果表明脂質(zhì)體Ⅱ相比于脂質(zhì)體Ⅰ在儲(chǔ)存過(guò)程中的pH、平均粒徑變化小，貯藏穩(wěn)定性更好。

魚(yú)油，薄膜-探頭式超聲，注乙醇-DHPM，納米脂質(zhì)體

魚(yú)油中富含二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）［1］。研究表明：這兩種多不飽和脂肪酸，不但可以有效的防治心血管疾病［2］、缺油癥、炎癥、癌癥、而且能夠調(diào)節(jié)血脂［3］、增強(qiáng)免疫力、健腦益智［4］以及保護(hù)視網(wǎng)膜［5］等，但DHA和EPA為多烯脂肪酸決定了它極易被氧化變質(zhì)，而且產(chǎn)生難聞的氧化味和對(duì)人體健康有害的氧化產(chǎn)物。為了克服魚(yú)油的這些缺點(diǎn)，充分利用優(yōu)質(zhì)的魚(yú)油資源，可將魚(yú)油繼續(xù)深加工制備成魚(yú)油納米脂質(zhì)體，提高抗氧化性，部分掩蓋其魚(yú)腥味［6］。

脂質(zhì)體（Liposome）或稱類脂小球、液晶微囊，是將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層形成的薄膜間隙，所制成的超微型球狀載體制劑，常用的制備方法有薄膜法、超聲法、擠壓法、French壓力法、冷凍干燥法、乙醇注入法、乙醚注入法、逆向蒸發(fā)法、鈣融合法［7-8］。本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用改進(jìn)的注乙醇—DHPM（動(dòng)態(tài)高壓微射流）法［9］制備的魚(yú)油納米脂質(zhì)體其各項(xiàng)性質(zhì)均較好，為了對(duì)本實(shí)驗(yàn)室制備的脂質(zhì)體進(jìn)行科學(xué)的評(píng)價(jià)，將自制脂質(zhì)體同傳統(tǒng)的優(yōu)化后薄膜—探頭式超聲法［10-11］進(jìn)行比較，以便為魚(yú)油納米脂質(zhì)體的制備提供更好的思路。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用薄膜—探頭式超聲法和注乙醇—DHPM法分別制脂質(zhì)體Ⅰ和脂質(zhì)體Ⅱ，并對(duì)兩種脂質(zhì)體的包封率和載量、平均粒徑及分布情況、Zeta電位、微觀形態(tài)和貯存穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為魚(yú)油納米脂質(zhì)體的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

魚(yú)油（EPA+DHA＞30%）南京森海生物油脂廠；大豆卵磷脂（≥90%） 德國(guó)Lipiod公司；膽固醇（A.R） 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純，北京索萊寶生物科技有限公司。

Microfluidizer Processor M-110EH微射流儀美國(guó)Microfluidics公司；NICOMP380/ZLS納米粒度分析儀美國(guó)PSS粒度分析儀公司；H-600透射電鏡、U-2910紫外分光光度計(jì)日本日立公司；JY98-IIIN超聲波細(xì)胞破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司；AJ-III原子力顯微鏡上海愛(ài)建納米科技發(fā)展有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1魚(yú)油納米脂質(zhì)體的制備薄膜—探頭式超聲法制備魚(yú)油納米脂質(zhì)體：參考文獻(xiàn)［10-11］的基礎(chǔ)上有所修改，將大豆磷脂（20mg/mL）∶魚(yú)油膽固醇∶吐溫-80按質(zhì)量比10∶1∶2加入無(wú)水乙醇中，在40℃下攪拌混勻，并超聲（300W）處理90s，將乙醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)完，在燒瓶壁形成一層薄膜，隨后用磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH=7.2）沖洗薄膜得到粗脂質(zhì)體，將粗脂質(zhì)體經(jīng)過(guò)超聲處理，即得到魚(yú)油納米脂質(zhì)體。

注乙醇—DHPM法制備魚(yú)油納米脂質(zhì)體［9］。

1.2.2包封率（EE）和載量（DL） 用標(biāo)準(zhǔn)曲線法繪制魚(yú)油石油醚溶液的線性回歸方程為A＝1.197X+0.0319，R2＝0.9974。并在274nm處測(cè)其包封率和載量［12］。

1.2.3粒徑分布和Zeta電位［13］分別取兩種方法在最佳條件下制備的脂質(zhì)體，加入蒸餾水稀釋到合適濃度，用Nicomp380/ZLS納米激光粒度分析儀測(cè)定粒徑大小和粒度分布，光源波長(zhǎng)360nm，散射角90°，樣品平行測(cè)三次。然后在Zeta Potential模式下測(cè)定Zeta電位，光源波長(zhǎng)635nm，電場(chǎng)10V/cm，電流0.2mA。

1.2.4形態(tài)考察及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

1.2.4.1透射電鏡（Transmission electron micrograph，TEM）、原子力顯微鏡（AFM）觀察運(yùn)用負(fù)染色法對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行透射電鏡觀察，在放大倍率60000×下觀察，工作電壓為75kV的透射電鏡下觀察魚(yú)油納米脂質(zhì)體的形態(tài)。AFM觀察用潔凈云母片快速刮層使樣品形成吸附膜；放置于空氣中自然干燥，取適量的去離子水洗脫未吸附的雜質(zhì)和樣品，重復(fù)兩次，待樣品自然干燥后待測(cè)［14-15］。

1.2.4.2穩(wěn)定性評(píng)價(jià)將脂質(zhì)體Ⅰ和脂質(zhì)體Ⅱ分裝于小瓶中，分別在冷藏（4℃）、常溫（25℃）條件下避光貯存，分別于0、7、14、21、28、35d取樣，按以下指標(biāo)對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)［16-17］。

a：外觀的變化：評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：－：溶液均一、無(wú)絮凝和沉淀；－＋：混懸液有少量絮凝和沉淀；＋：混懸液呈微黃色有少量絮凝和沉淀；＋＋：混懸液呈微黃色、有大量絮凝和沉淀。

b：pH的變化：用精密pH計(jì)分別測(cè)定兩種脂質(zhì)體不同貯存天數(shù)后的pH。

2　結(jié)果與分析

2.1兩種脂質(zhì)體的理化性質(zhì)比較

比較采用薄膜—探頭式超聲法制備魚(yú)油納米脂質(zhì)體Ⅰ和注乙醇—DHPM法制備魚(yú)油納米脂質(zhì)體Ⅱ的各項(xiàng)理化性質(zhì)。表1是測(cè)得脂質(zhì)體Ⅰ和脂質(zhì)體Ⅱ的理化性質(zhì)，脂質(zhì)體Ⅱ相比于Ⅰ脂質(zhì)體的EE、DL都明顯增大，但平均粒徑和多分散指數(shù)（PDI）減小，說(shuō)明DHPM的高壓作用比探頭式超聲的空穴和風(fēng)化作用對(duì)脂質(zhì)體顆粒的作用更明顯，可以明顯的降低脂質(zhì)體的粒徑，同時(shí)增大比表面積，使得包封率得到了一定的提升［18］。脂質(zhì)體Ⅱ相對(duì)于脂質(zhì)體Ⅰ有更小的Zeta電位，磷脂雙分子層聚集在一起時(shí)受到更小的靜電力，能夠更好的形成穩(wěn)定均一的脂質(zhì)體體系。

2.2脂質(zhì)體的形態(tài)觀察

2.2.1脂質(zhì)體的TEM圖圖1是兩種脂質(zhì)體放大60000倍的透射電鏡圖，脂質(zhì)體Ⅰ和脂質(zhì)體Ⅱ都呈圓形或不規(guī)則橢圓形，且脂質(zhì)體Ⅱ更加圓滑，顆粒更加飽滿，大小也相對(duì)均一，這與粒徑和DPI的結(jié)果是一致的。

表1　兩種方法制備的魚(yú)油納米脂質(zhì)體理化性質(zhì)Table 1　The characteristics and qualities of both fish oill nanoliposomesⅠandⅡwere measured

圖1?、窈廷虻耐干潆婄R圖Fig.1　TEM of nanoliposomeⅠandⅡ

2.2.2脂質(zhì)體的原子力顯微鏡圖圖2是原子力顯微鏡在3μm范圍內(nèi)觀察到的兩種脂質(zhì)體的形態(tài)，從圖2（ⅠB）中可以明顯的看出脂質(zhì)體Ⅰ輪廓不太清晰分布也不均勻，這可能由于探頭式超聲設(shè)備作用于溶液產(chǎn)生局部熱作用過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致，相比脂質(zhì)體Ⅰ而言，脂質(zhì)體Ⅱ更加均一，完整性更好。

2.3脂質(zhì)體的穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.3.1外觀的變化表2是貯存溫度和時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體Ⅰ和Ⅱ外觀的影響，從表2可以看出，在4℃條件下貯存，脂質(zhì)體Ⅰ在第28d開(kāi)始出現(xiàn)絮凝，脂質(zhì)體Ⅱ外觀沒(méi)有變化；在25℃條件下貯存，脂質(zhì)體Ⅰ在第7d開(kāi)始出現(xiàn)沉淀，而脂質(zhì)體Ⅱ在貯存第21d出現(xiàn)沉淀，總體來(lái)說(shuō)脂質(zhì)體Ⅱ相比于脂質(zhì)體Ⅰ更容易保存。

圖2　脂質(zhì)體Ⅰ和Ⅱ的AFM圖Fig.2　AFM image of nanoliposomeⅠandⅡ

表2　貯存溫度和時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體Ⅰ和Ⅱ外觀的影響Table 2　The effect of storage temperature and time on the appearance of liposomesⅠandⅡ

2.3.2pH的變化圖3是貯存溫度和時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體Ⅰ和ⅡpH的影響，由圖3可以看出，4℃貯存條件下脂質(zhì)體Ⅰ和Ⅱ的pH變化小，基本都在7.2±0.05范圍內(nèi)，25℃時(shí)隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)pH顯著降低，且脂質(zhì)體Ⅰ下降明顯快于脂質(zhì)體Ⅱ。由于超聲會(huì)產(chǎn)生瞬間高溫可能破壞了磷脂的結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定性下降，溫度從4℃上升到25℃會(huì)使磷脂發(fā)生氧化產(chǎn)生溶血卵磷脂和游離脂肪酸等，生成的這些產(chǎn)物不僅會(huì)使體系pH降低，還會(huì)加速脂質(zhì)體的氧化和水解［19］。脂質(zhì)體Ⅱ貯藏穩(wěn)定性也要明顯好于脂質(zhì)體Ⅰ。

2.3.3粒徑的變化圖4是貯存溫度和時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體Ⅰ和Ⅱ粒徑的影響，由圖4可以看出，4℃貯存35d可以看出兩種脂質(zhì)體的平均粒徑均增大，脂質(zhì)體Ⅱ平均粒徑由（127.3±7.6）nm增至（163.7±8.2）nm，脂質(zhì)體Ⅰ由（235±11.9）nm增大（352.5±14.8）nm；25℃貯存35d，兩種脂質(zhì)體平均粒徑也均在增大，且脂質(zhì)體Ⅰ的粒徑提高了4倍為（875.1±22.5）nm，已經(jīng)喪失了納米脂質(zhì)體的特性［20］；脂質(zhì)體Ⅱ平均粒徑由（127.3± 7.6）nm增大到（285.9±8.9）nm。綜上所述，脂質(zhì)體無(wú)論是貯存在4℃條件下還是25℃，脂質(zhì)體Ⅱ相比脂質(zhì)體Ⅰ有更好的貯藏穩(wěn)定性。

圖3　貯存溫度和時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體Ⅰ和ⅡpH的影響Fig.3　The effect of storage temperature and time on the pH of nanoliposomesⅠandⅡ

圖4　貯存溫度和時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體Ⅰ和Ⅱ粒徑的影響Fig.4　The effect of storage temperature and time on the particle size of nanoliposomesⅠandⅡ

3　結(jié)論

本文比較了薄膜分散—超聲法和乙醇注入—DHPM法制備的兩種魚(yú)油脂質(zhì)體的理化性質(zhì)：脂質(zhì)體Ⅱ比脂質(zhì)體Ⅰ的包封率更高，平均粒徑、PDI、Zeta電位小，說(shuō)明其顆粒聚集在一起時(shí)受到分子間作用力更小，更容易聚集形成納米脂質(zhì)體。TEM、AFM顯示脂質(zhì)體Ⅱ比脂質(zhì)體Ⅰ的顆粒更圓滑、更均勻飽滿、完整性更好。4℃和25℃條件下貯存35d的對(duì)比表明，貯存過(guò)程中脂質(zhì)體Ⅱ比脂質(zhì)體Ⅰ的pH、平均粒徑變化小，貯藏穩(wěn)定性更好。

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Physicochemical properties of fish oil nanoliposomes made by thin-film rehydration-ultrasonic and ethanol injection-DHPM

TU Zong-cai1，2，MA Da1，WANG Hui1，ZHANG Lu1，SHAO Xiao-mei1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Key Laboratory of Functional Small Organic Molecule，Ministry of Education，Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，China）

The merits and disadvantages of thin-film rehydration-ultrasonic method and ethanol injection-DHPM were evaluated by comparing the physicochemical properties of fish oil（FO）nano liposomes prepared under individual optimum conditions.（liposome I and liposome II，respectively）The polydisperse index，particle size，zeta potential，transmission electron microscopy and pH of liposomes was detected.Result：NanoliposomesⅡexhibited small eraverage particle，PDI and zeta potentialsize，than nano liposomes I.TEM and AFM analysis revealed that the particle integrity of liposome II was better than liposomes I.Conclusion：Compared with nanoliposomes I，nanoliposomesⅡ exhibites greater characteristies，and ethanol injection-DHPM could be a potent technique for the preparation of nanoliposomes.

fish oil；thin-film rehydration-ultrasonic method；ethanol injection-DHPM method；nanoliposomes

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0127-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.017

2013－11－11

涂宗財(cái)（1965-），男，博士，教授，研究方向：食物資源開(kāi)發(fā)與高效利用。

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2012CB126314）；江西省重大科技創(chuàng)新研究項(xiàng)目（20124ACB00600）。