環(huán)磷酰胺小鼠少精子模型的構(gòu)建及枸杞煎提液的治療作用*

許 衛(wèi) 樓哲豐 金江濤 王瓊丹 蔣亦雯 韓 奔 金龍金

溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院、生命科學學院, 浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室（溫州 325035）

·論 著·

環(huán)磷酰胺小鼠少精子模型的構(gòu)建及枸杞煎提液的治療作用*

許 衛(wèi)△樓哲豐△金江濤 王瓊丹 蔣亦雯 韓 奔 金龍金**

溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院、生命科學學院, 浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室（溫州 325035）

目的 研究環(huán)磷酰胺（CP）小鼠少精子模型的構(gòu)建方法，以及評價枸杞煎提液對少精子癥的治療作用。方法 小鼠分別以60、80、100mg/kg CP腹腔注射，qid，連續(xù)5d，測定精子相對數(shù)和睪丸組織切片，得出最適CP劑量；再以高低劑量（20g/kg、10g/kg）枸杞煎提液給最適CP劑量構(gòu)建的少精子小鼠灌胃14d，測定精子相對數(shù)、睪丸組織切片和流式細胞儀檢測生精細胞倍性。結(jié)果 3種劑量CP處理組精子相對計數(shù)、生精小管面積、直徑、生精上皮細胞層數(shù)（CMSE）均顯著低于空白對照組和生理鹽水組（P＜0.001）；枸杞高低劑量組精子相對計數(shù)、生精小管面積、直徑、CMSE顯著高于陽性對照組（P＜0.001）；枸杞高劑量組與陽性對照組比在單倍體細胞（1C細胞）比例上顯著降低，四倍體細胞（4C細胞）比例上顯著升高（P＜0.05），枸杞低劑量組與陽性對照組比在二倍體細胞（2C細胞）比例上顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論 60mg/kg CP為構(gòu)建小鼠少精子模型的適宜劑量；枸杞煎提液對少精子癥有一定治療效果，可能與促進4C細胞增殖有關(guān)。

少精子癥； 疾病模型, 動物； 枸杞

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是一種烷化劑，能夠損害男性生殖系統(tǒng)［1］，使精子形態(tài)異常，數(shù)目減少，活力降低［2］，以其構(gòu)建的少精子模型已逐漸用于實驗研究。枸杞常被用作補腎益氣，具有保護睪丸功能的作用。本實驗以不同劑量的CP構(gòu)建小鼠少精子模型，篩選出最適CP劑量，然后用枸杞煎提液治療最適CP劑量構(gòu)建的小鼠少精子模型，以研究CP小鼠少精子模型的構(gòu)建方法，以及評價枸杞煎提液對少精子癥的治療作用。

材料與方法

一、實驗動物

清潔級雄性ICR小鼠80只，4周齡，體重18～22g（購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物質(zhì)量合格證：SCXK（滬）2012-0002）。

二、主要試劑

蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），環(huán)磷酰胺（Alfa Aesar），枸杞。

三、實驗方法

（一）不同濃度CP構(gòu)建少精子模型

1. 分組和給藥：將40只小鼠隨機分為5組（每組8只）：空白對照組（Ⅰ組）、生理鹽水組（Ⅱ組：生理鹽水）、低劑量CP組（Ⅲ組：60mg/kg CP）、中劑量CP組（Ⅳ組：80mg/kg CP）、高劑量CP組（Ⅴ組：100mg/kg CP），每天腹腔注射1次，每次0.5mL，連續(xù)5d，飼養(yǎng)至第33d處死。

2. 附睪尾精子計數(shù)：取附睪尾，置于1mL PBS，剪碎，靜置15min，振蕩搖勻，靜置3min，取上清液；500μL PBS，振蕩搖勻，靜置3min，取上清液，重復(fù)一次；加1mL精子固定液，靜置3min，血細胞計數(shù)板計數(shù)。

3. 睪丸石蠟切片觀察生精小管直徑、面積、生精上皮細胞層數(shù)（CMSE）：取左側(cè)睪丸，常規(guī)石蠟包埋，HE染色。每個睪丸制作2張切片，每張切片隨機取4個高倍鏡視野，Image pro plus 6.0處理圖像。

（二）枸杞煎提液治療少精子模型

1. 枸杞煎提液制備：參照汪君民等［3］制備方法，用9倍體積水浸泡30min，加熱至沸騰，煎煮10min，取藥液；藥渣加7倍體積水，煎煮10min過濾，兩液混合、濃縮。

2. 分組和給藥：將40只ICR雄性小鼠隨機分為4組（每組10只）：陰性對照組（A組）、陽性對照組（B組）、枸杞低劑量組（C組）、枸杞高劑量組（D組）。A組腹腔注射生理鹽水，B、C、D組腹腔注射60mg/kg CP，每天1次，每次0.5mL，連續(xù)5d。第6d起A、B組生理鹽水灌胃，C、D組分別予10、20g/kg枸杞煎提液灌胃，每天1次，每次0.5mL，連續(xù)14d，飼養(yǎng)至第33d處死。

3. 附睪尾精子計數(shù)（同前）。

4. 睪丸石蠟切片觀察生精小管直徑、面積、CMSE（同前）。

5. 流式細胞術(shù)對中藥治療小鼠進行生精細胞倍性分析：右側(cè)睪丸去包膜，剪碎，2ml PBS，1000r/ min 2min，取上清，3000r/min 4min，棄上清。按照細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，用DNAMultiCycle軟件進行統(tǒng)計擬合分析。

（三）實驗計算方法

1. 精子懸液的精子數(shù)目（總精子數(shù)）=80小格內(nèi)的精子數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)

2. 精子相對計數(shù)（精子數(shù)/100mg附睪尾重）=附睪尾精子總數(shù)/附睪尾重（mg）×100

三、統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較應(yīng)用單因素方差（One-way ANOVA）分析，采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學處理。

結(jié) 果

一、不同濃度CP構(gòu)建少精子模型

（一）CP對小鼠精子相對計數(shù)的影響

各實驗組連續(xù)注射不同劑量CP后，精子相對計數(shù)值顯著低于Ⅰ組和Ⅱ組（P＜0.001）。隨著CP劑量的增加，精子相對計數(shù)逐漸減少。其中Ⅴ組精子數(shù)過少，無法計數(shù)（見表1）。

（二） CP對小鼠睪丸組織的影響

Ⅰ組和Ⅱ組生精小管細胞排列緊密有序，結(jié)構(gòu)清晰，層次分明，可見各級生精細胞和精子，間質(zhì)細胞緊密聚集于生精小管之間的疏松組織內(nèi)（見圖1A和圖1B）。Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組生精小管基底膜變薄，生精細胞數(shù)目及層次明顯減少，排列紊亂，甚至脫落、消失，管腔內(nèi)精子少見，間質(zhì)內(nèi)細胞數(shù)目明顯減少，間質(zhì)變大，各指標損傷程度Ⅴ組＞Ⅳ組＞Ⅲ組（見圖1C、圖1D和圖1E）。

表1 不同濃度CP對小鼠附睪尾重及精子相對計數(shù)值的影響（s）

表1 不同濃度CP對小鼠附睪尾重及精子相對計數(shù)值的影響（s）

注： 與Ⅰ組比, *P＜0.001； 與Ⅱ組比, △P＜0.001

組別 n 附睪尾重（g） 精子相對計數(shù)值（107/100mg）Ⅰ組 8 0.0307±0.0026 2.1490±0.3000Ⅱ組 8 0.0321±0.0032 2.1450±0.1910Ⅲ組 8 0.0230±0.0026 0.2352±0.0943*△Ⅳ組 8 0.0261±0.0020 0.0798±0.0405*△Ⅴ組 8 0.0223±0.0037 精子過少, 無法統(tǒng)計

各實驗組生精小管面積、直徑、CMSE均顯著低于空白對照組和生理鹽水組（P＜0.001）（見圖2）。

二、枸杞煎提液治療少精子模型

（一）枸杞煎提液對模型小鼠精子相對計數(shù)的影響

C組和D組精子相對計數(shù)顯著高于B組（P＜0.001）。B組、C組和D組精子相對計數(shù)顯著低于A組（P＜0.001）（見表2）。

圖1 不同劑量CP對小鼠睪丸組織的影響（×400）A：空白對照組，B：生理鹽水對照組，C：低劑量CP組，D：中劑量CP組，E：高劑量CP組

圖2 不同濃度CP對小鼠生精小管直徑、面積、CMSE的影響（s）注： 與Ⅰ組比, aP＜0.001； 與Ⅱ組比, bP＜0.001

表2 中藥治療對小鼠睪丸尾重及精子相對計數(shù)的影響（s）

表2 中藥治療對小鼠睪丸尾重及精子相對計數(shù)的影響（s）

注： 與A組比, *P＜0.001；與B組比, △P＜0.001

組別 n 附睪尾重（g） 精子相對計數(shù)（107/100mg）A 10 0.0322±0.0025 2.1055±0.2776 B 10 0.0273±0.0026 0.2282±0.0122* C 10 0.0294±0.0036 1.1466±0.0204*△D 10 0.0279±0.0034 1.1494±0.0269*△

（二）枸杞煎提液對模型小鼠睪丸組織的影響

A 組生精小管內(nèi)細胞排列緊密有序，結(jié)構(gòu)清晰，層次分明，可見各級生精細胞和精子，間質(zhì)細胞緊密聚集于生精小管之間的疏松組織內(nèi)（見圖3A）。B組生精小管基底膜變薄，生精細胞數(shù)目及層數(shù)明顯減少，排列紊亂，甚至脫落、消失，管腔內(nèi)精子少見，間質(zhì)內(nèi)細胞數(shù)目明顯減少，間質(zhì)變大（見圖3B）。C組生精小管內(nèi)細胞排列較為緊密，基本上可以分辨出各級生精細胞，數(shù)目增多，排列較規(guī)則，層次較分明，間質(zhì)內(nèi)細胞增多（見圖3C）。D組生精小管內(nèi)細胞排列緊密、有序，結(jié)構(gòu)清晰，可以清晰的分辨出各級生精細胞，數(shù)目增多，排列規(guī)則，層次分明，間質(zhì)細胞緊密聚集于生精小管之間的疏松組織內(nèi)（見圖3D）。

C組和D組生精小管面積、直徑、CMSE均顯著高于B組（P＜0.001），D組除層數(shù)外其它兩項指標恢復(fù)至與陰性對照組相近，比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見圖4）。

（三）枸杞煎提液對模型小鼠生精細胞倍性的影響

B組在1C、2C細胞比例上與A組比有顯著性差異（P＜0.05），D組與B組比在1C細胞比例上顯著降低，4C細胞比例上顯著升高（P＜0.05），C組與B組比在2C細胞比例上顯著升高（P＜0.05）（見圖5）。

圖4 枸杞煎提液對模型小鼠生精小管直徑、面積、CMSE的影響（s）注： 與A組比, aP＜0.001； 與B組比, bP＜0.001

圖5 枸杞煎提液對模型小鼠生精細胞倍性的影響注： 與A組比, aP＜0.05；與B組比, bP＜0.05

討 論

CP是臨床上常用的抗腫瘤藥物和免疫抑制劑，長期使用會損害生殖系統(tǒng)［4］。用CP構(gòu)建動物模型有利于探究相關(guān)機制和尋求可能的防治方法。Elangovan等［5］認為，低劑量CP會暫時性干擾正常雄性小鼠生殖系統(tǒng)，而高劑量CP會使生殖系統(tǒng)產(chǎn)生永久性的功能障礙，但對具體的劑量并沒有明確說明。目前對于能建立穩(wěn)定的小鼠少精子模型CP劑量也很少有報道。本實驗中，用不同劑量CP對小鼠染毒，均成功建立了小鼠少精子模型，且相對精子計數(shù)隨著CP劑量的增加逐漸減少，少精子程度加重。80mg/kg CP組與60mg/kg CP組比較精子相對計數(shù)明顯減少（P＜0.05），睪丸組織各指標損傷程度隨CP劑量的增加加劇，故此，我們認為相比于80、100mg/kg CP，60mg/kg CP為構(gòu)建穩(wěn)定的少精子小鼠模型的適宜劑量。

生精小管直徑的改變是反映精子發(fā)生狀態(tài)的一個很好的指標。光鏡下對各組睪丸組織HE染色切片進行觀察，可見枸杞高低劑量組生精小管細胞排列緊密、有序，結(jié)構(gòu)清晰，可以清晰的分辨出各級生精細胞，生精小管直徑、面積、生精細胞上皮層數(shù)明顯增多，而精子相對計數(shù)也較陽性對照組明顯增加，表明枸杞能明顯減輕小鼠睪丸組織細胞的損傷程度，修復(fù)睪丸組織的生理形態(tài)，且能促進精子的生成，起到一定的治療效果。

睪丸生精小管中的生精細胞由精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子組成。精子的發(fā)生過程分為3個階段：（1）精原細胞增殖時期：增殖過程中，通過精原細胞（2C）的分裂和分化，精原細胞產(chǎn)生初級精母細胞（4C）；（2）精母細胞成熟分裂時期：包括初級精母細胞和次級精母細胞（2C）的2次成熟分裂，即初級精母細胞經(jīng)過1次DNA復(fù)制，2次細胞分裂，結(jié)果染色體減少了一半，形成精子細胞（1C）；（3）精子形成時期：由圓形的精細胞變形和濃縮為蝌蚪狀的精子（1C）。

本實驗中陽性對照組1C細胞比例比陰性對照組低，2C細胞比例比陰性對照組高，推測CP致少精子可能是通過損傷1C細胞，或?qū)⒓毎芷谧钄嘤贕2期之后到M2末期之前的某個時期致使1C細胞比例下降，2C細胞比例上升。李曉彩［6］認為枸杞可降低生精細胞凋亡率，增加4C細胞比例，而保證生精細胞分化過程中精子細胞形成，確保單倍體成熟精子的生成數(shù)量，保證睪丸生殖功能。從圖5中，我們可以看出：相比于陽性對照組，枸杞高低劑量組4C細胞比例均有一定程度的升高，推測枸杞治療少精子的機制可能與提高4C細胞比例有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)：相比于陽性對照組，枸杞高低劑量組1C細胞比例都有所下降。結(jié)合圖4，相比于陽性對照組，枸杞高低劑量組精子相對計數(shù)顯著升高。我們推測：枸杞煎提液在提高4C細胞比例的同時，也促進1C細胞的增殖，但相比于4C細胞的增加量較低，因而在比例上反而降低。故此，我們認為枸杞治療少精子的機制為：促進精原細胞分裂和分化，從而促進4C細胞的增殖，進而間接提高睪丸生精功能，使精子數(shù)增加。

綜上所述，環(huán)磷酰胺能成功地構(gòu)建少精子癥小鼠模型，適宜劑量為60mg/kg CP。枸杞煎提液能使損傷后的雄鼠生殖系統(tǒng)得到一定的修復(fù)。初步推測CP能損傷1C細胞，或?qū)⒓毎芷谧钄嘤贕2期到M2末期之間，枸杞治療少精子的機制可能為促進4C細胞增殖，進而間接提高睪丸生精功能。

1 Zhang J, Tian Q, Yung Chan S, et al. Metabolism and transport of oxazaphosphorines and the clinical implications. Drug Metab Rev 2005； 37（4）： 611-703

2 Alvarez JG, Storey BT. Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa. Mol Reprod Dev 1995； 42（3）： 334-346

3 汪君民, 郭朝霞, 袁禮峰. 枸杞對運動大鼠腎臟凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達及血管緊張素的影響. 山東體育學院學報 2010； 26（10）： 49-55

4 Hoorweg-Nijman JJ, Delemarre-van de Waal HA, de Waal FC, et al. Cyclophosphamide-induced disturbance of gonadotropin secretion manifesting testicular damage. ACTA Endocrinol （Copenh） 1992； 126（2）： 143-148

5 Elangovan N, Chiou TJ, Tzeng W F, et al. Cyclophosphamide treatment causes impairment of sperm and its fertilizing ability in mice. Toxicology 2006； 222（1-2）： 60-70

6 李曉彩. 枸杞多糖對雙酚A所致小鼠睪丸生精細胞凋亡的保護作用研究. 保定： 河北農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文, 2012

（2015-04-08收稿）

Establishment of cyclophosphamide-induced oligopermia mouse model and the curative effect of Matrimony vine*

Xu Wei△, Lou Zhefeng△, Jin Jiangtao, Wang Qiongdan, Jiang Yiwen, Han Ben, Jin Longjin**
Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics,School of Laboratory Medicine and Life Science,Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China
Corresponding author： Jin Longjin, E-mail：1304071636@qq.com

Objective To establish Cyclophosphamide（CP）-induced oligopermia mouse model and evaluate the curative effect of Matrimony vine on oligospermia. Methods Male mice were intraperitoneally injected with CP of 60, 80, 100mg·kg-1·d-1 for 5 day, then they were comparatively analyzed by means of epididymal sperm count, paraffi n sections of testis for a suitable CP dose. The established oligospermia mouse models which were induced by the most suitable CP dose were intragastrically administrated with high and low doses of Matrimony vine （20g/kg, 10g/kg） for 14d, and then epididymal sperm count, paraffi n sections of testis and Spermatogenic cells test were analyzed respectively. Results Globus minor relative sperm count, area and diameter of seminiferous tubules, count measure spermatogenic epithelium （CMSE） in three doses of CP group were all signifi cantly lower than those in the blank control group and saline group （P ＜0.001）； In high and low doses of Matrimony vine groups, area and Globus minor relative sperm count and diameter of seminiferous tubules, CMSE were all significantly higher than those of the positive control group （P＜0.001）； the wolfberry high dose group was lower than the positive control group in the proportion of 1C cells and higher in the proportion of 4C cells （P＜0.05）； The wolfberry low dose group was higher than the positive control group at the ratio of 2C cells （P＜0.05）. Conclusion The dose of 60mg/kg is the best for establishment of oligopermia mouse model. Matrimony vine has therapeutic effects on model mice which may be associated with an increase in the number of tetraploid cells.

oligospermia； disease models, animal； Lycium barbarum

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.10.001

R 698.2

△共同第一作者

資助： 2014國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（20140343015）

**通迅作者, E-mail： 1304071636@qq.com