豬帶絳蟲組織蛋白酶B基因的克隆表達(dá)及抗血清的制備

孫銘苑，方懷盛，才學(xué)鵬

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730046)

豬帶絳蟲(Taenia solium)是一種重要的人畜共患寄生蟲，豬囊尾蚴能夠引起豬和人的囊蟲病。鑒于豬帶絳蟲病不僅能對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成危害，引發(fā)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還會(huì)危害公共衛(wèi)生安全，加之分布廣泛，該病已經(jīng)被聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織列為“需要根除的六大疾病”之一。迄今為止，針對(duì)豬帶絳蟲病或豬囊尾蚴病的藥物以及疫苗的使用仍存在許多問(wèn)題。蛋白酶是在從病毒到脊椎動(dòng)物都廣泛存在的一類酶，大分子蛋白質(zhì)和低聚肽均可被其降解。同時(shí)，蛋白酶與寄生蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和其在宿主體內(nèi)的存活息息相關(guān)。根據(jù)蛋白酶的蛋白水解機(jī)制，可將蛋白酶分為半胱氨酸蛋白酶和蘇氨酸蛋白酶等8類。組織蛋白酶B是半胱氨酸蛋白酶家族的重要成員之一。大量試驗(yàn)研究表明，組織蛋白酶B在寄生蟲攝取營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)發(fā)育、組織遷移、蛋白處理和活化以及免疫逃避等方面發(fā)揮重要作用，是預(yù)防及治療多種寄生蟲疾病的潛在靶標(biāo)分子。筆者首次克隆了豬帶絳蟲組織蛋白酶B基因的開放閱讀框序列，將去掉信號(hào)肽的部分進(jìn)行了原核表達(dá)，用重組蛋白免疫青紫藍(lán)灰兔，制備了高效價(jià)抗血清。

1 材料與方法

1.1 蟲體、試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 豬帶絳蟲由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所寄生蟲研究室提供;Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)、BL21(DE3)感受態(tài)、Trans 2k DNA Marker，均購(gòu)自北京全式金公司;pMD18-T克隆載體、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和Primer STAR HS DNA Polymerase均購(gòu)自TaKaRa(大連)有限公司;T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司;健康青紫藍(lán)灰兔，購(gòu)于蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司;原核表達(dá)載體pET-30a購(gòu)自Merck公司;限制性內(nèi)切酶EcoRI(HF)、NotⅠ購(gòu)自NEB公司;聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，購(gòu)自 Millipore公司;鎳NTA瓊脂糖凝膠FF購(gòu)自GenScript公司;兔抗豬辣根過(guò)氧化物酶(HRP)酶標(biāo)IgG、山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)酶標(biāo)IgG均購(gòu)自Sigma公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬帶絳蟲總RNA的提取及cDNA合成。豬帶絳蟲總RNA的提取按照Trizol Reagent(Invitrogen)說(shuō)明書進(jìn)行操作，相關(guān)器皿經(jīng)高溫烘烤，試劑、耗材均使用無(wú)RNase產(chǎn)品。按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行操作，利用提取的RNA和隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 組織蛋白酶B基因的擴(kuò)增。通過(guò)比對(duì)豬帶絳蟲數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneDB，篩選到組織蛋白酶B的開放閱讀框序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物:

TscpB-F:5＇-ATGTCTGCGATGAAGATGTC-3＇

TscpB-R:5＇-CTAGTTTTGCGGGAGACCG-3＇

以第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序如下:95 ℃ 4 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 70 s，35個(gè)循環(huán);72℃10 min;4℃終止。使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體于16℃水浴中連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α。通過(guò)菌液PCR對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，將陽(yáng)性克隆送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 組織蛋白酶B基因序列分析。通過(guò)ProtParam在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析。利用SignalP 4.1在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)PredictProtein在線軟件(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用MotifScan在線軟件(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)對(duì)糖基化位點(diǎn)以及翻譯后的修飾位點(diǎn)等進(jìn)行預(yù)測(cè);通過(guò)SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè);使用BioEdit軟件的Kyte＆Doolittle方法計(jì)算蛋白質(zhì)序列的疏水性分布。通過(guò)SWISS-MODEL在線軟件(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)3D結(jié)構(gòu)。

1.2.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)克隆到的TscpB序列及序列分析，在信號(hào)肽之后設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，送至上海生工生物技術(shù)有限公司合成。以測(cè)序正確的PCR產(chǎn)物為模板，用帶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將純化后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-30a分別經(jīng)EcoRI和NotⅠ雙酶切后連接過(guò)夜。利用PCR和雙酶切對(duì)其進(jìn)行鑒定，將陽(yáng)性克隆送交上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET30a-TscpB。

1.2.5 豬帶絳蟲組織蛋白酶B的原核表達(dá)及表達(dá)形式鑒定。將含有重組質(zhì)粒的菌液接于5 ml Kan濃度為100 mg/ml的LB培養(yǎng)液中，于37℃ 220 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。同時(shí)設(shè)置空載體和未誘導(dǎo)組作為對(duì)照。將培養(yǎng)12 h后的菌液再轉(zhuǎn)接至含5 ml Kan濃度為100 mg/ml的 LB培養(yǎng)液中，于37℃ 220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至吸光度OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，于37℃條件下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h時(shí)分別從未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)組中各取出1 ml菌液。12 000 r/min離心1 min后，收集菌體。將處理后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定表達(dá)后鑒定蛋白的表達(dá)形式。

1.2.6 蛋白純化及Western-blotting分析。按照確定的誘導(dǎo)條件大量(1 L)誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體。經(jīng)PBS反復(fù)洗滌、-70℃凍融3次處理后，按照Invitrogen公司的鎳瓊脂糖凝膠FF操作說(shuō)明對(duì)樣品進(jìn)行純化。將純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后進(jìn)行電轉(zhuǎn)，用5%脫脂奶粉于4℃過(guò)夜封閉。用1∶200倍稀釋的豬囊尾蚴病陰性血清和陽(yáng)性血清分別與PVDF膜于室溫下振蕩孵育1.5 h后，加入HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG(1∶20 000倍稀釋)，于室溫下振蕩孵育1 h后，加入DAB底物溶液顯色。

1.2.7 多克隆抗體的制備及免疫血清效價(jià)的測(cè)定。測(cè)定純化后的蛋白濃度，將蛋白于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｃ庖咔?，在試?yàn)兔耳緣靜脈采血并分離血清，于-20℃下保存，作為陰性對(duì)照。每3周免疫1次，共免疫4次，每只兔子的免疫劑量為200 μg/次。第1次免疫使用弗氏完全佐劑，蛋白與佐劑采用1∶1比例混合，使用乳化機(jī)將混合物乳化至穩(wěn)定的油包水型乳劑。在兔子背部及大腿實(shí)施皮下多點(diǎn)注射，免疫7 d后在耳緣靜脈采血，將分離的血清于-20℃下保存?zhèn)溆?此后的3次免疫都使用弗氏不完全佐劑。待抗體的滴度符合要求后頸動(dòng)脈采血，將分離的血清于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩２捎瞄g接ELISA方法對(duì)制備的免疫血清的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，使用酶標(biāo)儀讀取OD450nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬帶絳蟲總RNA的提取 經(jīng)核酸電泳檢測(cè)，提取的總RNA呈現(xiàn)28 S、18 S和5 S共3條條帶(圖1)。

2.2 豬帶絳蟲組織蛋白酶B基因的擴(kuò)增 重新設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到不含信號(hào)肽序列的組織蛋白酶B的基因片段(圖2)。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增的序列為1 025 bp，與GeneDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)(http://www.genedb.org/)顯示的數(shù)據(jù)完全一致。

2.3 組織蛋白酶B基因的序列分析 序列分析表明，TscpB蛋白由20種氨基酸組成，其中Leu含量最多，Trp含量最少。TscpB蛋白的理論分子質(zhì)量為39.71 ku，等電點(diǎn)為6.63，原子組成為C1757H2696N488O518S24。帶電荷的殘基共占20.8%，其中負(fù)電荷殘基占10.7%，正電荷殘基占10.1%。不穩(wěn)定系數(shù)為48.47，證明該蛋白質(zhì)可能不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為71.32，總平均親水性為-0.384。通過(guò)對(duì)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TscpB二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占27.5%，β-折疊占14.8%，無(wú)規(guī)則卷曲(L)占57.7%。對(duì)蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有7個(gè)Tyr、4個(gè)Thr、8個(gè)Ser，為可能的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)SignalP 4.1 Server分析發(fā)現(xiàn)，TscpB最可能的剪切位點(diǎn)在第23和24位氨基酸殘基之間，證明該蛋白可能存在信號(hào)肽。利用MotifScan對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明該蛋白有3個(gè)半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)，分別為半胱氨酸活性位點(diǎn)、組氨酸活性位點(diǎn)、天冬酰胺活性位點(diǎn);2個(gè)N端糖基化位點(diǎn);6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn);4個(gè)CK2蛋白激酶磷酸化位點(diǎn);6個(gè)肉豆蔻酰化位點(diǎn)，具有組織蛋白酶B結(jié)構(gòu)域。SMART分析表明，1～23位氨基酸構(gòu)成該蛋白的信號(hào)肽序列，證明該蛋白可能是分泌型蛋白(圖3)。該蛋白3D結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析相一致(圖4)。

2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoRI和NotI雙酶切，產(chǎn)物出現(xiàn)預(yù)期大小的目的片段(圖5)。測(cè)序結(jié)果表明，已經(jīng)成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒。

2.5 組織蛋白酶B的原核表達(dá)及蛋白純化 將重組質(zhì)粒pET30a-TscpB轉(zhuǎn)化入感受態(tài)，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDSPAGE電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有大約38 ku的表達(dá)條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致(圖6)。經(jīng)鑒定，該重組蛋白以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)。

將所有重組蛋白過(guò)柱層析純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)最終獲得了較高純度的重組蛋白(圖7)。定量檢測(cè)純化后的蛋白最終質(zhì)量濃度為1 mg/ml。

2.6 rTscpB的Western blotting結(jié)果 從圖8可以看出，rTscpB與豬囊尾蚴病陽(yáng)性血清反應(yīng)，在38 ku左右處出現(xiàn)特異性條帶，而與陰性血清無(wú)反應(yīng)，證明rTscpB具有抗原性。2.7 ELISA檢測(cè)結(jié)果 從圖9可以看出，4次免疫后兔子血清的抗體效價(jià)可達(dá)1∶2.04×105。

3 討論

在最早的生化試驗(yàn)中，蠕蟲的提取物被發(fā)現(xiàn)具有木瓜蛋白酶的活性，且這種活性能夠被一些蛋白酶抑制劑特異性抑制。從20世紀(jì)80年代開始，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，這些蛋白酶中的某些成分被證明具有和哺乳動(dòng)物組織蛋白酶B相似的活性［1］。在絳蟲中，多房棘球絳蟲的組織蛋白酶B基因的研究較多。研究表明，多房棘球絳蟲能夠分泌兩種組織蛋白酶B，主要定位于原頭蚴、可育囊和生發(fā)層［2］。在酸性環(huán)境下，該酶能夠發(fā)揮水解活性，降解BSA、IgG、纖連蛋白和膠原蛋白［3-6］。迄今為止，關(guān)于豬帶絳蟲組織蛋白酶B的研究報(bào)道非常少，僅有試驗(yàn)表明豬帶絳蟲六鉤蚴時(shí)期ES抗原中含有組織蛋白酶B［7］。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)是目前被最廣泛使用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。作為一種常用的表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)，如工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、表達(dá)周期短及表達(dá)量高等。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的突出優(yōu)點(diǎn)是可以高水平地表達(dá)外源基因，其表達(dá)產(chǎn)量可以達(dá)到自身總蛋白的80%以上。

筆者擴(kuò)增到豬帶絳蟲組織蛋白酶B的開放閱讀框，長(zhǎng)度為1 074 bp，編碼357個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)工具對(duì)其進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明豬帶絳蟲組織蛋白酶B的理論蛋白分子質(zhì)量約為39.71 ku，其1～23位氨基酸構(gòu)成該蛋白的信號(hào)肽序列，說(shuō)明豬帶絳蟲組織蛋白酶B很可能是一種分泌型的蛋白。筆者采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行大量表達(dá)，成功獲得了大小約為38 ku的豬帶絳蟲組織蛋白酶B的重組蛋白，此目的蛋白以包涵體的形式存在。Western blotting結(jié)果表明，豬囊尾蚴病陽(yáng)性血清可以與純化的重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，而陰性血清不發(fā)生反應(yīng)。這說(shuō)明被豬囊尾蚴感染過(guò)的豬血清中存在組織蛋白酶B的抗體，同時(shí)也證實(shí)了該蛋白具有抗原性，可能具有潛在的免疫診斷價(jià)值。該試驗(yàn)中高效價(jià)抗血清的制備為進(jìn)一步探究該酶的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。

［1］CAFFERY C R，RYAN M F.Characterisation of proteolytic activity of excretory-secretory products from adultStrongylus vulgaris［J］.Veterinary Parasitology，1994，52(3/4):285-296.

［2］SAKO Y，NAKAYA K，ITO A.Echinococcus multilocularis:Identification and functional characterization of cathepsin B-like peptidases from metacestode［J］.Experimental Parasitology，2011，127(3):693-701.

［3］GHONEMIN H，KLINKERT M Q.Biochemical properties of purified cathepsin B fromSchistosoma mansoni［J］.International Journal for Parasitology，1995，25(12):1515-1519.

［4］WILSON L R，GOOD R T，PANACCIO M，et al.Fasciola hepatica:Characterization and cloning of the major cathepsin B protease secreted by newly excysted juvenile liver fluke［J］.Experimental Parasitology，1998，88(2):85-94.

［5］LI A H，MOON S U，PARK Y K，et al.Identification and characterization of a cathepsin L-like cysteine protease fromTaenia soliummetacestode［J］.Veterinary Parasitology，2006，141(3/4):251-259.

［6］BECKHAM S A，PIEDRAFITA D，PHILLIPS C I，et al.A major cathepsin B protease from the liver flukeFasciola hepaticahas atypical active site features and a potential role in the digestive tract of newly excysted juvenile parasites［J］.The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2009，41(7):1601-1612.

［7］ZIMIC M J，INFANTES J，LóPEZ C，et al.Comparison of the peptidase activity in the oncosphere excretory/secretory products ofTaenia soliumandTaenia saginata［J］.The Journal of Parasitology 2007，93(4):727-734.